穇子多酚的分离纯化及其抗氧化能力研究

黄月 ，向海芹，王双辉，龚意辉，陈致印*

1. 湖南人文科技学院农业与生物技术学院（娄底 417000）；2. 海南大学食品科学与工程学院（海口 570228）

穇子为一年生禾本科穇属草本植物，又名龙爪稷、鸡爪谷、龙爪粟等，广泛分布于热带地区，我国长江以南及西藏、安徽、河南、湖南、广西等地均有种植[1-2]*。穇子的种子为球形，表面具有一层难以去除的种皮，其棕色穇子皮含有较高的多酚类物质（其中苯甲酸衍生物约占85%），使穇子具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等诸多功能[3-7]*。多酚是具有苯环并结合多个羟基化学结构的化合物总称，常以酚酸类、黄酮类、单宁类和花色苷类化合物形式存在，具有很强的抗氧化作用，是一类值得开发的天然抗氧化剂[8-9]。

穇子多酚作为穇子的重要功能成分，许多研究表明[10-13]*，穇子多酚具有较强的体外抗氧化能力和抗菌活性，可有效延缓花生油的氧化作用和龙眼的采后生理活动，对金黄色葡萄球菌等食源性微生物具有抗菌作用。穇子多酚的提取是其应用的前提，王双辉等[10]*采用超声波辅助双水相法提取穇子多酚，得率是3.191 5 mg/g。王乐等[14]*发现穇子多酚共有11种酚类物质且不同溶剂提取的组分不尽相同。然而，关于穇子多酚纯化方面的研究鲜有报道。大孔树脂作为一种天然的聚合物吸附剂，具有较高的孔隙率、良好的稳定性、较好的选择性等特点，常被用于天然活性成分的分离纯化。

试验以穇子为原料，采用乙醇辅助生物酶法提取穇子多酚，并用A-21型大孔树脂对粗提液进行纯化，以抗坏血酸为阳性对照，测定穇子多酚粗提液、穇子多酚纯化组分抗氧化能力大小，为进一步探究穇子多酚的生物活性提供基础。

1 材料与仪器

1.1 试验材料与试剂

穇子（湖南省新化县湖南隆庆农业开发有限公司）；抗坏血酸标准品（HPLC＞98%）、没食子酸标准品（HPLC＞98%）：北京索莱宝科技有限公司；果胶酶（30 000 U/g）、纤维素酶（50 U/mg）、乙醇（分析纯）、大孔树脂（A-21）、无水三氯化铁（AR）、石油醚（60～90 ℃，分析纯）、无水碳酸钠（AR）、二水合磷酸二氢钠（AR）、无水磷酸氢二钠（AR）、铁氰化钾、硫酸亚铁（AR）、三氯乙酸（AR）：上海麦克林生化科技有限公司；福林-酚试剂（SL9010）、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚：北京酷来博科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：奥默生物技术（上海）有限公司；氯化氢、过氧化氢、硫酸（均为分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

电子天平（FA2004型，上海良平仪器仪表有限公司）；紫外分光光度计（754型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ5200DB型，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（101型，北京中兴伟业仪器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050型，巩义市予华仪器有限责任公司）；数显恒温水浴锅（HH-8型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；旋转蒸发器（RE-52C型，巩义市予华仪器有限责任公司）；循环水式真空泵（SHZ-DⅢ型，巩义市予华仪器有限责任公司）；离心机（TD5Z型，湖南凯达科学仪器有限公司）；万能高速粉碎机（DE-500 g，浙江红景天工贸有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 穇子多酚的粗提

新鲜穇子粉碎过0.425 mm孔径（40目）筛后脱脂，取脱脂穇子粉末于锥形瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入酶液（酶浓度1%，W纤维素酶∶W果胶酶=7∶3），在60 ℃恒温水浴酶解2 h，后用4 000 r/min离心15 min，得第1份上清液，用适量的70%乙醇溶液洗涤滤渣，在同样条件下离心得第2份上清液，将2次上清液合并后于45 ℃旋蒸，去除有机溶剂后得粗提液[15]*。

1.3.2 穇子多酚的纯化

大孔树脂预处理：将大孔树脂置于烧杯中，加入无水乙醇盖过大孔树脂，搅拌排出气泡，静置24 h后用蒸馏水润洗至无乙醇味即可，剩余大孔树脂浸泡在无水乙醇中，在4～9 ℃冰箱中保存，备用[16]*。

参照曹雪文[17]*的方法，稍作修改。称取20.0 g预处理好的大孔树脂湿法装柱，连续加入去离子水，使大孔树脂在柱内均匀充分紧实，将25 mL穇子多酚粗提液缓慢加入层析柱中，控制流速1 滴/s，收集流出液并测定其多酚浓度，用50 mL去离子水、乙醇（质量分数20%～95%）进行梯度洗脱，同样控制流速在1 滴/s，用试管定量收集洗脱液，每管5 mL，共收集50管，待测，绘制洗脱曲线。

1.3.3 多酚含量的测定

参照王乐等[14]*的方法，稍加修改。分别取1 mL水和没食子酸标准液（10，20，30，40和50 μg/mL）于具塞试管，加入1 mL福林酚试剂，摇匀静置5 min，加入4 mL质量分数10%的碳酸钠溶液，于25 ℃水浴加热反应1 h后，在波长760 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制没食子酸标准曲线图。

取1 mL待测样品液于具塞试管中，加入1 mL福林酚试剂，后续同上。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定

在杨立凤等[18]*的方法上进行一定调整。精密称取10 mg DPPH，用乙醇溶液溶解，定容到50 mL，制成质量浓度0.2 mg/mL的工作液，于4 ℃避光保存。分别吸取2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚纯化液、VC溶液于具塞试管中，加入2 mL DPPH溶液，涡旋振荡摇匀，避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光度，所有试验重复3次，下同。清除率计算如式（1）所示。

式中：A1为样品测定的吸光度；A2为无水乙醇代替样品的吸光度。

1.3.5 羟基自由基（·OH）清除能力的测定

在闫旭宇等[19]*的方法上稍作修改。分别精确移取2 mL穇子多酚粗提溶液、穇子多酚纯化液、VC溶液于试管中，加入浓度同样为6 mmol/L的FeSO4溶液、水杨酸和过氧化氢溶液，各2 mL，于37 ℃水浴加热反应20 min后，在波长510 nm处测定吸光度A1。根据式（2）计算清除率。

式中：A1为样品测定的吸光度；A2为蒸馏水代替过氧化氢溶液的吸光度；A3为蒸馏水代替样品溶液的吸光度。

1.3.6 超氧根（O2-*）清除能力的测定

参照Chen等[20]*的方法，稍加修改。分别取0.2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚纯化液、VC溶液于试管中，加入5.7 mL Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.20）和0.1 mL邻苯三酚溶液（6 mmol/L），混匀后在室温反应6 min，加入0.1 mol/L的HCl溶液终止反应，在320 nm处测定吸光度A1。清除率计算同式（1）。

1.3.7 Fe3+*还原能力的测定

参照胡栋宝等[21]*的方法并稍加完善。分别取0.5 mL穇子多酚粗提液、穇子多酚纯化组分、VC溶液于具塞试管中，分别加入2.0 mL pH 6.6磷酸缓冲溶液和2.0 mL 1%铁氰化钾溶液，在50 ℃水浴中加热20 min，加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液，避光静置6 min后，在700 nm处测定吸光度。

1.3.8 ABTS+*自由基清除能力

参照Shen等[22]*的方法，加以修改。取7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液，各100 mL，混匀，避光反应12～16 h得ABTS母液。取ABTS母液，用蒸馏水稀释，使其在734 nm处吸光度为0.70±0.02，生成ABTS工作液。分别取1 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚纯化液、VC溶液于试管中，加入4 mL ABTS工作液，避光反应6 min，于734 nm测定其吸光度A1。清除率计算同式（2）。

1.3.9 数据处理与分析

试验数据均采用Excel整理，使用GraphPad prism 6进行绘图和方差分析，进行Multiple comparisons和t检验，分析差异的统计显著性，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

根据1.3的方法，绘制没食子酸标准曲线，见图1。没食子酸的回归方程为y=0.011 62x-0.018 6，R2*=0.997 2，表明其能够较好地拟合穇子多酚含量的计算。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 柱层析分析

穇子多酚粗提液洗脱曲线如图2所示。穇子多酚粗提液经去离子水、乙醇（质量分数20%～95%）梯度洗脱后得到3个组分FMP-1、FMP-2和FMP-3（图中按出峰顺序依次命名），其中：FMP-2的出峰时间虽然较晚，但峰面积大，说明该组分多酚含量较高，纯化效果较好；FMP-1和FMP-3这2个组分的出峰所需时间较长，且峰面积小，说明多酚含量低，因此后续不对其进行分析。同时，经过图1回归方程得出，粗提液穇子多酚浓度为113.22 μg/mL，经过柱层析后，纯化组分为220.30 μg/mL。

图2 穇子多酚柱层析洗脱曲线

2.3 DPPH自由基清除能力

穇子多酚粗提液、穇子多酚纯化液FMP-2及VC溶液的DPPH自由基清除能力如图3所示。在20～100 μg/mL浓度范围内，三者的清除效果均在70%～72%之间，并与浓度呈正相关。VC溶液的DPPH自由基清除效果优于穇子多酚纯化液FMP-2及粗提液，且随着浓度的增加，穇子多酚FMP-2的清除率逐渐上升，并接近于VC溶液，不存在显著性差异，但与粗提液之间在各浓度都存在显著差异（P＜0.05）。这与胡会刚等[23]*研究发现菠萝皮渣多酚经纯化后的DPPH抗氧化活性明显提高相一致，这可能是由于较高纯度的FMP-2结构比粗提物更容易与DPPH自由基匹配。

图3 穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对DPPH自由基的清除效果

2.4 羟基自由基（·OH）清除能力

穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对·OH自由基清除能力如图4所示。浓度在20～100 mg/mL时，随着浓度的上升，穇子多酚纯化液FMP-2和粗提液清除·OH自由基的效率明显上升，且两者之间存在显著差异（P＜0.05），穇子多酚纯化组分FMP-2与VC溶液的清除效果相当，都明显高于粗提液，该结果与穇子多酚抗氧化活性的研究[10-11]*结论基本一致。这可能是由于FMP-2和VC转移氢给自由基的效率相差不大，而粗提液含有较多杂质成分，导致其清除效果不如FMP-2和VC。

图4 穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对·OH自由基清除能力

2.5 超氧根（O2-*）清除能力

超氧根清除率如图5所示。穇子多酚纯化液FMP-2随着浓度的上升，其清除超氧根（O2-*）的效率相差不大，基本恒定在80%左右，与VC效果相当，而粗提液随着浓度的上升，清除效率大幅上升，浓度由20 mg/mL上升到100 mg/mL时，清除率从20%多陡增至60%以上。这可能是由于粗提液中含有其他成分，对超氧根清除率存在影响。

图5 穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对超氧根（O2-*）的清除效果

2.6 Fe3+*还原能力

FRAP铁离子还原法常用于测定物质的总抗氧化活性，其原理是测定物质将Fe3+*还原成Fe2+*的能力，以此来反映物质的抗氧化活性[24]*。由图6可知，穇子多酚粗提液、穇子多酚纯化液FMP-2及VC溶液对Fe3+*还原能力都与浓度呈正相关。溶液浓度从20 μg/mL上升至100 μg/mL时，穇子多酚纯化液FMP-2的吸光度增大最多，从0.400增大到1.017，而粗提液的吸光度增长不大，VC也呈现阶段性增长，且三者之间两两都具有显著性差异（P＜0.05），可能的原因是穇子多酚经纯化后去除了大部分杂质，对铁离子的清除作用明显增强，而粗提液中杂质太多，对Fe3+*还原存在一定影响，导致还原能力并无大幅变化。

图6 穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对Fe3+*的还原能力

2.7 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基的苯并噻唑结构具有两亲性，故ABTS自由基的消除可通过转移氢或转移电子实现[25]*。穇子多酚粗提液、穇子多酚纯化液FMP-2及VC溶液对ABTS自由基的清除能力如图7所示。浓度在80%以下时，VC对ABTS自由基的清除率不足4%，远低于穇子多酚的清除率。穇子多酚粗提液在不同浓度下对ABTS自由基的清除率都在80%以上，且变化不大，但与穇子多酚纯化液FMP-2之间存在显著差异（P＜0.05）。穇子多酚纯化液FMP-2随着浓度的上升，其清除率也成倍增加，从6%增加到50%以上。穇子多酚粗提液远高于穇子多酚纯化液，可能是粗提液中还有其他成分，更容易与ABTS自由基结合[25]*。特别注意的是，VC浓度80 μg/mL时，其清除率不到2%，浓度100 μg/mL时，清除率升至99.88%，这可能是由于低浓度的VC溶液对ABTS自由基的清除效果极其微弱，而到一定浓度时就会表现出较强的清除效果[26]*。

图7 穇子多酚粗提液、纯化液及VC溶液对ABTS自由基的效果

3 结论

以乙醇辅助生物酶法提取穇子多酚，采用A-21型大孔树脂对多酚粗提液进行纯化，纯化后穇子多酚含量由113.22 μg/mL提升至220.30 μg/mL，王双辉等[10]*采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取穇子多酚，得率为3.191 5 mg/g。王乐等[14]*采用酸性乙醇浸提法提取穇子多酚，得率为118.91 mg/mL。试验多酚得率比这2个结果都低，这可能是由于提取方法不同所导致。

经过纯化后的穇子多酚纯化液，对DPPH自由基清除能力、羟基自由基（·OH）清除能力、超氧根（O2-*）清除能力、Fe3+*还原能力较粗提液有明显的提升。这可能是由于粗提液经纯化后，去除大部分杂质所导致。对于穇子多酚纯化液的纯度、组分、结构及性质，需通过进一步研究分析，才能阐述其作用机理。