维生素C有效期的快速测定

王晓辉*，史小琴，庄文昌，董黎明，李靖，蔡可迎

徐州工程学院材料与化学工程学院（徐州 221111）

物理化学动力学是药物配方设计、制剂稳定性评价、药代动力学研究与药物有效期预测的理论基础。药物有效期的预测方法有留样观察法和经典加速法。前者于室温储存至失效，需要至少1年。经典加速法采用加热加速分解反应，可以缩短测定的时间，代表性的案例如阿司匹林有效期的测定[1-2]*。维生素C是药食同源的水溶性营养补充剂，在生活环境中不太稳定，分解产物较多[3-4]*。以维生素C水溶液为研究对象，针对复杂反应体系，以导数光谱为依据，消除共存组分对维生素C测定中的背景干扰，测定维生素C的含量，为推动维生素C的应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验原理

阿司匹林的水解反应仅为一步[1-2]*，还原型维生素C（抗坏血酸，AA）的降解途径、过程和产物随外界条件有所不同。在15～95 ℃、pH 3.2～8.6，较为公认地遵循一级反应模型，可能的主要产物有氧化型维生素C（脱氢抗坏血酸，DHA）、糠醛类物质（F，包括糠醛、5-羟甲基糠醛）、2, 3-二氧代-L-古洛糖酸（DKA）[4-6]*。根据Arrhenius定律，随着温度的降低，生成上述产物的各步反应活性逐渐减弱，温度降低至室温附近时，以AA与DHA之间的可逆转化为主[4,*7]*，见图1。

图1 AA的降解途径和产物

研究表明，AA、DHA、DKA与F的吸收分别位于紫外光区的190～320，190～255，190～240与190～320 nm[8-10]*。在AA的最大紫外吸收波长266 nm处，干扰测定的只有F。在试验中发现，随着温度的降低，生成F的速率有降低趋势，温度降至40 ℃时，F不再生成，以此寻找到能消除F对AA在266 nm处产生干扰的上临界温度，这使AA简便、准确、快速定量并预测有效期成为可能。

AA降解的一级反应速率方程为：

式中：CAA为AA在时间t时的质量浓度，mg/mL；t为反应时间，min；K为表观反应速率常数，min-1*。

对式（1）积分得到：

式中：C0为AA的初始质量浓度，mg/mL；A0、At为反应液在初始和时间t时266 nm处的吸光度。

将ln（At/A0）对t作图，得一直线，直线的斜率为反应速率常数K。同理可以得到不同温度时的对数吸光度-时间关系曲线（式3）。

依据Arrhenius方程由拟合直线斜率得到的lnK对1/T作图。将式（3）外推至298.15 K即可计算25 ℃时的表观反应速率常数值。

根据一级反应的有效期公式τ0.9=ln 10/9/（K298.15K）计算出AA的有效期。

1.2 仪器和试剂

恒温水浴6套，紫外分光光度计1台，分析天平1台，50 mL烧杯1只，超声波仪1台，秒表5块，100 mL磨口锥形瓶5套，移液枪5只，1 000 mL容量瓶1套。AA标准品。

1.3 试验方法

准确称取7.0 mg AA标准品于蒸馏水中超声溶解并定容于1 000 mL容量瓶，配成0.007 0 mg/mL AA的标准溶液，以蒸馏水为空白对照，测定其吸光度，同时作为反应液，冷藏现用。

将0.007 0 mg/mL AA水溶液分装于100 mL磨口锥形瓶内，用保鲜膜套住塞好瓶塞的瓶口，并用橡皮筋固定（防止瓶塞受压弹出）后，分别置于恒温水浴中，静置，计时进行加速试验。

每隔10 min取样1次，将石英样品池迅速放入冰水中冷却1 min，以终止反应。测定反应液的吸光度。

2 数据记录及处理

在反应60 min时，采用Origin 8.0软件绘制所测不同温度的AA水溶液的相对吸光度-波长及其一阶、二阶导数关系曲线。由图2（a）可见，在300～360 nm左右为分光光度计的紫外、可见光源信号切换区，所测吸光度不太稳定。由图2（b）可见，在50 ℃和60 ℃时，AA的紫外吸收主峰区域（220～300 nm）的一正一负的一次导数峰有2个，位于220～275 nm和275～300 nm，说明重叠峰个数为2，分别对应于AA和F（糠醛、5-羟甲基糠醛中的一种）。随着反应温度的降低，到40 ℃时，后者消失。对比图2（c）发现，相应区域处不规则的二正一负的二次导数峰也消失。这是因为F（糠醛、5-羟甲基糠醛）的特征吸收波长在276 nm和284 nm[10]*，与AA在266 nm的中心峰位不重合，并且在所研究区域具有完整的紫外吸收峰，导数峰的消失提示反应液中F的浓度为0，继续降低温度，F不再生成，不再对266 nm处AA的测定产生干扰。过低的温度也不利于保证适宜的反应速率和更好地控制反应液浓度，试验温度选择在30～40 ℃之间进行。

图2 AA水溶液的紫外光谱（a）、一阶（b）和二阶（c）导数光谱

记录不同温度的AA反应液在266 nm波长处的吸光度，见表1，并计算在时间t时的ln（At/A0）。

表1 反应液中AA在266 nm的吸光度和ln（At/A0）

将表1的ln（At/A0）对t作图，可以得到不同温度时的对数吸光度-时间关系曲线，如图3所示。结果显示，30，35和40 ℃的表观反应速率常数分别为0.002 3，0.003 4和0.005 0 min-1*。

图3 ln（At/A0）和t的关系

由拟合直线斜率得到的lnK对1/T作图，如图4所示。拟合直线的线性回归系数R2*为0.997，能很好地吻合Arrhenius方程，将式（3）外推至298.15 K即可计算25 ℃时的表观反应速率常数值，K298.15K为0.001 8 min-1*。

图4 lnK和1/T的关系

根据一级反应的有效期公式τ0.9=ln 10/9/（K298.15K），计算出AA水溶液在25 ℃时的有效期τ0.9为68.7 min，约1.1 h。

3 结论

以导数光谱为依据，消除F在AA的最大紫外吸收波长266 nm处的背景吸收对AA定量测定的干扰，确定试验温度30～40 ℃。采用经典加速法测定AA的分解速率常数，根据Arrhenius公式，计算AA在25 ℃时的有效期约1.1 h。所建的降解动力学理论模型较为理想。经试验证实，该设计不需大型仪器设备，方法简单、准确、节约、高效，结果与实际吻合。结合分解途径看，试验对AA的配方设计和贮存环境的选择具有指导意义。