抗结核药物贝达喹啉与氯法齐明耐药的研究现状

尚园园 聂文娟 黄海荣 初乃惠

结核病是威胁全球公共卫生的重大挑战之一，在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)大流行之前，结核病是单一病原体感染导致死亡的主要原因，排名高于HIV感染/艾滋病。世界卫生组织报告显示，2020年全球结核病患者(HIV阴性)死亡例数约为130万，高于2019年，大约有1/6的死亡患者为耐多药/利福平耐药结核病(multidrug-/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)和广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)患者[1-2]。MDR/RR-TB和XDR-TB治疗成功率低，花费大，不良反应多，而在COVID-19大流行的背景下，MDR/RR-TB患者接受治疗的例数较2019年下降15%，增加了结核病防治的难度。

近年来，贝达喹啉(bedaquiline，Bdq)和氯法齐明(clofazimine，Cfz)的使用对缩短MDR/RR-TB和XDR-TB治疗疗程和改善患者治疗结局起到相当大的作用。2019年世界卫生组织推荐Bdq与Cfz作为治疗MDR/RR-TB的A组和B组药物，是治疗MDR/RR-TB的强有力武器[3]。Bdq和Cfz均通过损害分枝杆菌的能量代谢来发挥作用[4]，具体作用机制不同。尽管Bdq与Cfz之间存在交叉耐药，但两者联合使用时仍具有额外的杀菌效果[5-6]，笔者旨在总结Bdq和Cfz的耐药机制，以及临床治疗中Bdq和Cfz耐药的出现情况，讨论如何延缓Bdq和Cfz获得性耐药的积累和传播。

一、Bdq和Cfz用于MDR/RR-TB和XDR-TB的治疗现状

Bdq是一种抑制三磷酸腺苷(ATP)的抗分枝杆菌药物[7-8]。近几年有许多研究表明：Bdq治疗MDR/RR-TB和XDR-TB可以缩短痰培养阴转时间，改善患者治疗结局，并且在全口服、短疗程RR-TB 治疗方案中的使用也取得令人鼓舞的研究结果[9-11]。2019年世界卫生组织推荐Bdq作为MDR/RR-TB标准治疗方案中的核心药物[3]。到2020年年底为止，已有109个国家使用Bdq作为MDR/RR-TB和XDR-TB治疗的药物[2]。因此，在临床的应用过程中除了需要警戒Bdq的药物不良反应[12]，还应迅速识别Bdq的耐药性，从而预防耐药结核病患者治疗失败的发生。

Cfz于20世纪50年代在都柏林合成，最初于1969年被用于治疗麻风病。孟加拉国进行的短程MDR-TB治疗方案得出令人惊喜的结果[13]，证明了Cfz的重要性。随后，中国的临床试验也证明Cfz可以缩短MDR-TB的治疗时间，改善MDR-TB的治疗结局[14-15]。鉴于这些重要的结果，并考虑到与其他二线抗结核药物相比，其价格相对较低，所以2019年世界卫生组织治疗指南将Cfz列为MDR/RR-TB的B组药物，与环丝氨酸和特立齐酮推荐为首选治疗药物的一部分[3]。目前，Cfz的确切作用机制尚不清楚，但认为可能是干扰氧化还原循环导致膜不稳定和功能障碍，产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)和抑制呼吸链等，干扰结核分枝杆菌的生长[16-19]。

二、Bdq和Cfz耐药的发生率及检测现状

Bdq在MDR/RR-TB中的耐药发生率较低，约为2.3%[20]。2005年，Andries等[21]在体外分离了Bdq的耐药菌株，其突变率在4倍最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)时约为5×10-7，8倍MIC时突变频率为5×10-8[21]。目前，结核分枝杆菌对Bdq耐药相关的基因有3个，分别为atpE、Rv0678和Rv2535c(表1)。atpE基因突变株大多数是在体外分离株中获得的，这与Huitric等[22]研究结果一致。Zheng等[20]、Liu等[23]、Xu等[24]、Ismail等[25]对Bdq耐药结核分枝杆菌临床分离株测序均未见atpE基因突变。但Zimenkov 等[26]及Migliori等[27]对Bdq耐药结核分枝杆菌临床分离株进行基因检测发现有atpE基因突变，而随后atpE突变基因被Rv0678突变基因取代，这可能与该突变体的适应度成本增加有关[27]。对Bdq治疗3个月以上、痰培养持续阳性并且出现MIC值升高的结核分枝杆菌临床分离株进行全基因组测序，发现大部分菌株显示Rv0678基因发生点突变和插入突变[28-31]。上述研究也表明，在使用Bdq的治疗过程中可能会产生Bdq耐药，并强调了使用全基因组测序联合MIC值检测对于耐药性监测的重要性。Rv0678[32]和Rv2535c[33]基因的突变与Bdq和Cfz交叉耐药相关。

Cfz在0.25 mg/L的药物浓度下突变频率为5×10-6。在>1 mg/L的情况下无Cfz耐药突变体生长[19]。有明确的证据表明，ROS水平与细菌细胞的突变率有关[34]。南非的一项研究表明，Cfz的耐药率为7.4%(29/391)[25]，在没有使用过Cfz的患者体内分离出的结核分枝杆菌耐药率为5.8%，考虑主要是由耐药菌株的传播引起的[35]。国内西南地区MDR-TB患者对Cfz耐药率为3.4%(3/88)[20]。目前，Cfz耐药相关基因有4个，分别为Rv0678、Rv1979c、Rv2535c和Rv1453(表1)。

表1 贝达喹啉和氯法齐明的耐药基因

三、Bdq和Cfz的耐药机制

抗结核药物的耐药性通过多种机制进化，主要涉及以下两种机制[36]：一是原发性或传播性耐药；二是继发性或获得性耐药。获得性耐药的产生往往是与患者治疗方案不合格或治疗依从性差、药物吸收不良或药物-药物相互作用导致血药浓度不达标等原因有关，进而导致菌株基因突变产生耐药。

1. Bdq耐药基因：2005年，Andries等[21]最先提出Bdq耐药与atpE基因突变有关，该基因是一种编码分枝杆菌ATP亚基C的高度保守基因[37]，具有81个氨基酸序列。当该基因发生突变时，可以阻止Bdq与C亚基结合，从而导致H+转移和ATP产生减少[7]。目前已知的该基因突变位点有9个[21-22, 27, 37]，分别来自于体外诱导菌株和临床株。atpE基因突变使Bdq MIC值增加了4～128倍[22]。有72%的耐药菌株中未发现atpE基因突变，这也表明至少存在1个与ATP合成酶无关的Bdq耐药位点[22]。最新研究表明，atpE基因187G→C点突变导致的A63P突变与Bdq耐药密切相关[38]。

2. Cfz耐药基因：(1)Rv1979c基因：Rv1979c基因编码了具有渗透酶活性的氨基酸膜转运蛋白，该转运蛋白具有481个氨基酸，可能与Cfz耐药性有关[19]。Zhang等[19]描述的体外诱导耐药菌株Rv1979c基因的突变位点为V351A，Xu等[24]发现在1株耐药临床分离株中，Rv1979c突变位点为 V52G。但仍有一些Cfz耐药菌株经过序列分析后未见Rv0678和Rv1979c基因的突变[4, 20]。Xu等[24]和Pang等[39]的研究发现，未使用过Cfz的患者分离出具有Rv1979c突变的菌株，可能与Phelan等[40]的研究中提及的Rv1979c与异烟肼耐药性相关。Rv1979c基因的突变对Cfz的MIC值变化的影响最小，MIC值增加2～4倍[19, 24, 33]。(2)Rv1453基因：Rv1453基因全长为1266 bp，与qor、Rv1455和PE_PGRS28基因相邻，Li等[41]首次证实了Rv1453基因影响了结核分枝杆菌对Cfz的易感性，可导致菌株的MIC值增加4倍。Rv1453基因编码的转录调控蛋白可以与包含RNA聚合酶结合位点的qor基因序列结合，从而抑制转录过程，通过增加ATP、降低ROS和氧化应激来降低菌株对Cfz的敏感性。

3. Bdq与Cfz交叉耐药基因：南非的一项研究表明，曾经暴露于Cfz是患者出现Bdq耐药的危险因素，Cfz和Bdq的交叉耐药可能会削弱Bdq对MDR/RR-TB的临床应用价值[42]。Cfz耐药性的分离株中有接近1/3会对Bdq具有交叉耐药性[23, 25]，但研究中Cfz耐药结核分枝杆菌分离株的样本数量较少。目前，关于Bdq和Cfz交叉耐药的相关基因主要是Rv0678和Rv2535c。

Rv0678基因：Rv0678是一种有翼螺旋DNA结合域的转录抑制因子[43]，已被证明与邻近外排泵基因MmpS5/MmpL5间区的回文序列结合，Rv0678基因的突变使得该位点的抑制解除，从而导致Rv0678、mmpS5和mmpL5的转录上调，继而促使药物外排。Hartkoorn等[32]使用定量PCR发现携带Rv0678突变的H37Rv相对于野生型H37Rv，mmpL5和Rv0678表达量分别增加11.6和11.2倍。MmpS5/MmpL5外排泵的最基本的功能是输出铁载体[44]，在高铁条件下外排泵的表达被下调，在低铁条件下外排泵的表达可被上调[45]，但未在女性患者分离菌株中观察到Rv0678高突变率[46]，Rv0678突变与特定的结核分枝杆菌谱系无关[46]。Andries等[47]的研究表明，体外Bdq获得性耐药菌株耐药机制是由Rv0678的突变引起的，此基因突变时会导致Bdq和Cfz交叉耐药。与维拉帕米联用时可以降低Cfz和Bdq的MIC值，这也表明Bdq耐药机制除了atpE靶点的突变外，还存在药物外排耐药机制[48]。Rv0678基因的变异数量众多且分散在整个基因中，可在其209个不同位置鉴定出237个独特的变异[38]，常见的突变是在nt192-198、nt138-144或nt212-216区域的移码突变[46-47]，一般发生在nt138-144和nt212-216的移码突变中，Bdq的MIC值增加了至少8倍[49]。若发生 Gln31Arg和Ser53Pro的碱基互换[20]，一般会使Bdq和Cfz的MIC值增加2～4倍(表2)。最新的研究表明，Rv0678138-139insG与Bdq耐药相关(OR=6.91，P=0.016)。Rv0678基因的突变是目前Bdq与Cfz交叉耐药的主要原因。但最近研究发现，未曾使用过Bdq或Cfz的患者中也报道了该基因突变[24]，可能与Rv0678基因突变导致药物外排与Bdq或Cfz内在性和获得性耐药机制有关[47]。目前，Rv0678基因突变导致低水平耐药对治疗结果的影响尚不清楚[42]。一些临床研究显示，出现Rv0678突变的患者临床结局较差，但研究患者数量较少[23, 30, 42]。在对准广泛耐药结核病和XDR-TB患者给予Bdq和Cfz治疗时，因交叉耐药机制的存在，需要警惕治疗过程中Bdq耐药性的出现[50]。为了提高对Bdq和Cfz表型-基因型相关性的认识，需要全面报告基因型和表型数据，以及治疗结果的信息，特别是药物治疗失败的患者。

表2 贝达喹啉和氯法齐明的基因突变位点

Rv2535c：Rv2535c是一种脯氨酸特异性氨基肽酶，与大肠埃希菌中的PepP、乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌中的PapA(YqhT)具有同源性[33]。Rv2535c的点突变是在使用Bdq治疗的小鼠中被选择出来的[33]。与外排泵抑制剂联用时, Bdq的MIC值出现下降说明药物外排可能参与耐药的机制，但其作用机制可能与Rv0678的突变导致的外排泵高表达不同，Rv2535c突变可能通过不同的方式增加该转运体的外排，如防止mmpL5的降解，因其在氨基端附近包含一个Val-Pro-Pro延伸[33]。Rv2535c基因突变位点目前有6种[19, 33, 51](表2)。Rv2535c突变会使Bdq和Cfz的MIC值均略有增加(4倍)。当菌株出现Rv2535c基因突变，并没有导致Bdq和Cfz完全耐药，可以通过增加药物剂量获得更好的抗结核作用[33]。Ioerger 等[51]在MDR-TB和XDR-TB患者中发现Rv2535c基因突变，氨基酸突变类型为Ser66Pro。但Xu等[24]和Liu等[23]的研究表明，Cfz耐药的临床分离株中没有发现Rv2535c基因突变，说明Rv2535c基因突变主要参与Bdq和Cfz交叉耐药，并不是Cfz的耐药机制。Liu等[23]研究也表明，在没有已知耐药靶点突变的情况下，Bdq治疗后存在Cfz获得性耐药，表明可能存在其他交叉耐药的机制，仍需要对这2个分离株进行全基因组测序分析，以确定新的耐药机制。

4. 其他分枝杆菌有关Bdq和Cfz交叉耐药的相关基因：(1)MAB2299c基因：MAB2299c基因编码TetR转录调控因子，MAB2299c的点突变或缺失可导致外排泵基因MmpS/MmpL转录上调相关导致脓肿分枝杆菌对Bdq与Cfz的交叉耐药，会使Bdq与Cfz的MIC值升高2～8倍[52]。(2)mmpT5基因：mmpT5基因的突变与Bdq耐药相关，该基因调控鸟分枝杆菌复合群的MmpS5/MmpL5操纵子。该靶点发生突变时，也会导致药物外排增加[53]。

四、Bdq和Cfz血药浓度与耐药相关性

长期治疗方案中的药物剂量不足或间断用药，导致药物浓度不达标会成为耐药性突变的一个主要决定因素。半抑菌药物剂量已被证明可以促进结核分枝杆菌对药物产生耐受性[55]。若结核病患者的治疗方案中只对单一药物敏感，将选择出对该药物耐药的少量细菌继续生存下去，最终导致治疗失败和复发[3]。Bdq是细胞色素P450同工酶3A4的底物，Cfz是细胞色素P450同工酶3A4的体外抑制剂，理论上当Bdq与Cfz同时给药时，两者间可能存在药代动力学的相互作用，可能导致Bdq剂量增加，从而增加Bdq的毒性。Maartens等[56]研究表明，Cfz对Bdq药代动力学相互作用差异没有统计学意义。糖尿病可能会影响Bdq血药浓度，从而导致Bdq治疗失败，Gour等[57]临床前研究表明，给予患有糖尿病小鼠400 mg/d的Bdq治疗2周，随后200 mg/次，3次/周的Bdq剂量治疗，与正常小鼠相比，Bdq最大药物浓度为(259±77) ng/ml，AUC0-24下降38%～40%，但仍需进一步的临床数据来支持这一研究结论。性别和体质量会影响Bdq和Cfz的血药浓度，2021年的研究指出，体质量与Bdq和Cfz的药物浓度参数相关，性别是Bdq的显著协变量，男性的最低药物浓度相对女性较高[58]。南非的一项研究首次从药物遗传学角度阐述了rs776746基因(CYP3A45*3)与Bdq血浆清除速度较慢相关(P=0.0017)，rs75285763基因(CNTN5)与Cfz血浆清除率慢相关，但可能存在偶然性[59]。在一项获得性Bdq耐药的报告中显示，对MDR-TB患者分离的菌株进行全基因组测序发现，尽管Bdq停用1年，菌株仍可能发生Rv0678突变[60]，停药后出现Bdq的耐药考虑可能与其半衰期长有关[61]。国内也有报道指出，在完成Bdq治疗的患者中可在停药52周后检测到Bdq[62]，这表明在治疗结束后，Bdq较长的半衰期可能有利于耐药人群的选择。因此，应考虑在治疗方案中计划终止伴随药物前4～5个月停用Bdq，以减少或避免作为单一药物的长期暴露[28]。建立Bdq和Cfz药代动力学/药效学(PK/PD)模型将有助于预测疗效和降低耐药性[63]。

五、预防Bdq和Cfz耐药性的产生

为了更早发现药物的耐药性及预防耐药的产生，建议采取以下措施：(1)早期发现药物的耐药性是阻止耐药菌株传播的关键措施，建议在使用这两种药物前进行基线MIC值的检测。世界卫生组织强烈呼吁为Bdq开发准确和可重复的药物敏感性检测方法，并建议在没有特定药物敏感性试验的情况下，通过MIC值评估监测Bdq的耐药情况直至培养阴转[28]。连续对治疗过程中的菌株进行全基因测序也有助于将MIC值与耐药位点相联系，并有助于预测药物的耐药性；(2)多种有效药物联用(至少4种有效药物)可以防止药物耐药性的产生，新型抗结核药物和现有抗结核药物的各种联合疗法应成为未来研究的重点；(3)监测治疗期间患者的血药浓度有助于优化治疗[64]，同时需要注意与Bdq和Cfz有共同代谢途径的药物，例如艾滋病的抗病毒药物、乙型肝炎的抗病毒药物等，如果这些药物与Bdq和Cfz一起使用应监测血浆药物浓度，以确保适当的药物治疗，并尽量减少获得耐药性的风险[28]。

六、展望

Bdq与Cfz作为世界卫生组织推荐用于治疗耐多药肺结核的A组和B组药物[3]，是治疗MDR-TB的强有力武器。目前，对于Bdq和Cfz的耐药机制，仍亟待加强研究，如体外诱导的Cfz突变菌株97%具有Rv0678突变[19]，但Cfz临床耐药菌株中只有不到40%的分离株存在已知的Cfz耐药的基因突变，我们仍需对Cfz耐药机制进行研究；Rv2535c功能的丧失会导致Bdq和Cfz的交叉耐药，但具体作用机制目前仍不十分清楚；Rv0678和Rv2535c基因的多样性对药物MIC值的影响及治疗结局的影响仍需更多的临床数据说明它们之间的联系。对于含Bdq和Cfz的治疗方案，最重要的问题是对Bdq和Cfz药物进行耐药性监测(MIC值、全基因组测序)、探索Bdq与Cfz的耐药新机制，以及评价在药物治疗过程中MIC值的变化与临床治疗疗效的关系，能够对未来开发Bdq和Cfz耐药快速检测方法和针对耐药结核病患者进行个体化治疗奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献尚园园：阅读文献、撰写论文；聂文娟：提供基金项目支持；黄海荣：指导内容修改；初乃惠：指导综述选题及评阅修改论文