常山酮对高原肺动脉高压模型大鼠心肺功能的影响及其机制研究

王江涛，马博华，沈会华，何佳，尹东锋，王瑞，李悟△

高原肺动脉高压（high-altitude pulmonary hypertension，HAPH）是机体暴露于海拔2 500 m 以上的高原环境后，因缺氧引起肺通气功能代偿性增加、肺血管收缩，进而导致肺动脉压力持续性增高、肺血管重构及相关心肌疾病的发生，该病的发病率及病死率均较高［1-2］。高原缺氧环境可导致肺组织低氧诱导因子-1α（HIF-1α）含量显著上调，进而促进下游血管内皮生长因子（VEGF）、内皮素-1（ET-1）等基因的表达，它们共同参与HAPH 的发生发展过程［3］。虽然近年来对低氧性肺动脉高压的研究不断增多，但其治疗措施仍不理想。常山酮（halofuginone，HF）是从植物常山中提取的喹唑酮类物质，具有抗血管肥厚、抑制细胞增殖和组织纤维化等作用，近来也被应用于肺动脉高压的研究［4］，但对高原环境诱导的肺动脉高压疗效仍不明确。本研究拟通过低压低氧舱模拟海拔6 000 m高原环境，建立HAPH 大鼠模型，分析HF 对HAPH 的改善作用，并通过检测HIF-1α、VEGF及ET-1表达水平探讨其可能的机制，以期为HAPH的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠50 只，体质量（200±20）g，购于新疆医科大学动物中心，动物生产许可证号：SYXK（新）2016-0003。动物实验方案通过新疆军区总医院动物伦理委员会审查。

1.1.2 试剂与仪器 HF（上海易恩化学技术有限公司，纯度＞97%），乌拉坦（上海泰坦科技股份有限公司，纯度＞99%），肝素钠注射液（上海第一生化药业有限公司）；大鼠HIF-1α、VEGF、ET-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自上海优选生物科技有限公司。西北特殊环境人工实验舱（中国人民解放军新疆军区总医院），HX-200 小动物呼吸机、RM62160C 型多道生理信号采集处理系统及压力传感器（成都仪器厂），LEICA RM2135回旋式切片机（上海兴曼生物科技有限公司），N-117M 显微镜（济南利科医疗器械有限公司），TDZ5台式离心机（湖南赫西仪器装备有限公司），DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与干预 根据随机数字表法从50只雄性SD大鼠中抽取40只，于模拟6 000 m高原环境的西北特殊环境人工实验舱中（压力47．3 kPa，相对氧浓度10%）建立HAPH 大鼠模型，并分为模型组、低剂量组（HF 0．5 mg/kg）、中剂量组（HF 1 mg/kg）、高剂量组（HF 2 mg/kg）；另10只作为对照组于舱外喂养，所有大鼠均可随意获取水和食物。各实验组大鼠每天药物灌胃1次，模型组和对照组给予等量蒸馏水灌胃，连续4周后进行检测。

1.2.2 平均肺动脉压（mPAP）测定 各组大鼠腹腔注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉，平卧位固定于手术台上，行气管插管术后连接小动物呼吸机（呼吸频率60次/min，潮气量6 mL，呼吸比3∶2）。待生命体征稳定后打开胸腔，充分暴露肺脏和心脏，用充满肝素化生理盐水（0．9%氯化钠溶液+25 U/mL 肝素）的硬质聚乙烯导管迅速插入右心室，导管另一端与压力传感器及生理信号记录仪相连监测压力变化，测定各组大鼠右心室收缩压（RVSP），mPAP=0．61×RVSP+2［4］。

1.2.3 右心室肥厚指数（RVHI）测定 测压后处死大鼠，取出心脏，用生理盐水冲洗，沿房室沟剪去左、右心房及大血管根部组织，沿室间隔边缘分离出右心室（RV）、左心室+室间隔（LV+S），用滤纸吸干水分后称质量，计算RVHI=RV/（LV+S）×100%。

1.2.4 肺血管重塑程度评定 切取大鼠左肺组织，置于4%多聚甲醛中固定后沿肺门横断取材，常规石蜡包埋，切片厚度约4 μm，行HE染色后在光学显微镜下观察肺小动脉变化情况。

1.2.5 ELISA 测定大鼠血清和肺组织HIF-1α、VEGF、ET-1含量 经大鼠下腔静脉取血5 mL，3 000 r/min离心10 min，留上清液备用；取大鼠右肺前叶0．1 g 匀浆后，3 000 r/min 离心10 min，留上清液备用。应用ELISA 试剂盒测定大鼠血清和肺组织中HIF-1α、VEGF、ET-1含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25．0 软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较方差齐用LSD-t检验，方差不齐用Dunnett's T3检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mPAP 和RVHI 测定结果 与对照组比较，模型组mPAP 和RVHI 均明显升高（P＜0．05）；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠mPAP和RVHI均明显降低（P＜0．05）；与低剂量组比较，中、高剂量组大鼠mPAP 均明显降低（P＜0．05）；中剂量和高剂量组大鼠mPAP 和RVHI 差异无统计学意义。见表1。

2.2 各组大鼠肺血管形态学改变 对照组大鼠肺小动脉管壁薄、管腔大；模型组大鼠肺小动脉管壁明显增厚、管腔明显狭窄，以动脉中膜平滑肌层增厚为主，表现出肺小动脉重塑的特征；低、中、高剂量组大鼠肺小动脉重塑呈现出不同程度的减轻，以中、高剂量组改善效果显著。见图1。

Tab.1 The results of mPAP and RVHI of rats in each group表1 各组大鼠mPAP和RVHI测定结果（n=10，±s）

Tab.1 The results of mPAP and RVHI of rats in each group表1 各组大鼠mPAP和RVHI测定结果（n=10，±s）

＊＊P＜0．01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，P＜0．05；表2同；1 mmHg=0．133 kPa。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F mPAP（mmHg）15．16±0．48 37．48±0．71a 32．00±0．76b 23．57±3．17bc 22．79±1．79bc 259．020＊＊RVHI（%）22．93±1．79 54．29±4．90a 45．08±5．28b 41．52±5．59b 39．47±2．34b 71．012＊＊

2.3 大鼠血清和肺组织HIF-1α、VEGF、ET-1 含量测定结果 与对照组比较，模型组血清和肺组织HIF-1α、VEGF、ET-1含量均明显升高（P＜0．05）；与模型组比较，中、高剂量组血清和肺组织HIF-1α、VEGF、ET-1 含量均降低（P＜0．05），而低剂量组仅肺组织VEGF、ET-1 含量降低（P＜0．05）；与低剂量组比较，中、高剂量组肺组织VEGF 及ET-1 含量降低（P＜0．05）；中剂量组和高剂量组各指标比较差异均无统计学意义。见表2。

3 讨论

HAPH是因高原缺氧不适应或不良适应而引起的以肺动脉压持续升高、肺血管重构及肺血管平滑肌细胞过度增殖等为特征的进展性疾病，是高原肺水肿、高原心脏病等高原性疾病的初始环节［5-6］。目前临床上针对HAPH的治疗手段主要包括脱离高原环境、长期氧疗、钙离子通道阻滞剂、前列环素类药物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂等，但这些治疗措施仅能缓解症状，尚不能逆转疾病进展，严重影响了HAPH 患者的生活质量，因此寻找新型治疗药物迫在眉睫［7］。

HF作为中药常山的主要活性成分，已知在骨关节炎［8］、肺癌［9］、纤维化疾病［10］、自身免疫病［11］等方面疗效确切。HF能通过调节Th17和Treg细胞的平衡来改善小鼠自身免疫性关节炎［12］。HF 可以通过抑制炎性因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-18的释放进而抑制肺纤维化及细胞凋亡，改善脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤［13］。此外，有研究发现，HF 也可作为一种有效的肺血管扩张剂，使肺血管舒张从而减轻慢性缺氧引起的肺动脉高压，并有望成为一种治疗肺动脉高压的药物［4］。本研究基于HAPH大鼠模型的结果也显示，中、高剂量HF 对HAPH 有较明显的改善作用，能有效降低HAPH 大鼠的平均肺动脉压，减轻右心室肥厚，改善肺血管重塑。

高原环境下长期慢性缺氧会导致HIF-1α 在体内迅速累积，从而进一步激活下游基因VEGF、ET-1等异常表达［14-15］。研究表明［16］，HIF 信号参与低氧性肺动脉高压的病理生理过程，是形成慢性高山病的重要因素。HIF-1α作为一种转录因子，其表达受氧气浓度影响，并与血管生成、能量代谢、红细胞生成密切相关；VEGF 和ET-1 作为HIF-1α 重要的靶基因，前者是促进新生血管形成的关键因子，后者可引起肺血管强烈收缩及血管平滑肌细胞增殖，两者共同加速肺动脉高压的形成［3］。因此，抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 表达可能是防治HAPH 的重要靶标。HF 已被证实对HIF-1α、VEGF 及ET-1 具有抑制作用。Kunimi 等［17］发现HF 能抑制视网膜缺血再灌注小鼠模型中HIF-1α的表达，从而起到神经保护作用。Assis等［18］进行体内和体外实验发现HF能降低骨髓中VEGF含量，抑制细胞VEGF分泌和阻断转化生长因子-β信号转导，从而减轻白血病小鼠模型的血管生成。Qin 等［19］在人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞中发现HF能阻断与ET-1介导的病理性肥大激活相关的基因表达。但目前关于HF 在HAPH中对HIF-1α、VEGF及ET-1的研究较为缺乏。

Fig．1 Morphological changes of pulmonary vessels in each group(HE staining×200)图1 各组大鼠肺血管形态学改变（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and ET-1 contents in serum and lung tissue between five groups of rats表2 各组大鼠血清和肺组织HIF-1α、VEGF和ET-1含量比较（n=10，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and ET-1 contents in serum and lung tissue between five groups of rats表2 各组大鼠血清和肺组织HIF-1α、VEGF和ET-1含量比较（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0．01。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F HIF-1α血清97．44±4．24 137．82±10．26a 128．59±12．65 116．79±9．07b 111．41±12．27b 23．533＊＊肺组织101．54±12．62 153．85±10．76a 146．54±9．39 129．36±7．29b 115．90±17．67b 31．739＊＊VEGF血清1 746．67±127．37 2 426．67±242．80a 2 315．00±165．93 1 935．00±121．02b 1 886．67±127．22b 32．135＊＊肺组织1 236．67±139．87 1 733．33±89．39a 1 488．33±103．13b 1 336．67±116．32bc 1 281．67±88．30bc 34．113＊＊ET-1血清357．27±7．11 500．00±61．54a 463．64±29．38 394．09±38．70b 374．09±19．62b 28．469＊＊肺组织315．45±33．27 460．91±38．63a 400．91±19．40b 359．55±30．23bc 331．36±36．82bc 32．724＊＊

本研究结果显示，HAPH 大鼠血清和肺组织HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平明显升高，提示其与肺动脉压升高等症状有一定的相关性。HF干预后，在HAPH 大鼠症状有效减缓的同时，血清和肺组织HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平也明显降低，进一步提示HF改善HAPH大鼠平均肺动脉压、右心室肥厚和肺血管重塑的作用可能与抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平相关，但关于HF 对VEGF 及ET-1 的抑制是直接作用还是由于抑制了上游HIF-1α 而起的间接作用，还有待进一步验证。

综上，HF 对大鼠HAPH 具有一定的防治作用，其机制可能与抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 表达有关，但具体机制尚待进一步的研究确定。