中药复方延缓肾间质纤维化研究进展*

李 蔓,陈亚楠,赵 晰△

(1.天津市北辰区中医医院,天津 300499;2.天津中医药大学第一附属医院,天津 300381)

肾间质纤维化(RIF)是肾脏对各种类型损伤的一种非特异性反应,各种慢性和进展性肾脏疾病最终的病理结局,也是一种不可逆性的病理改变,主要的病理特征表现为大量聚集的细胞外基质沉积在肾间质和肾小管,以及各类细胞因子的释放、浸润、肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、细胞外基质(extra cellular matrixc,ECM)降解失衡等因素,加速了肾小球硬化,最终造成肾脏功能的丧失与衰竭[1],因此延缓肾脏纤维化,改善肾脏功能,对于慢性肾脏病的患者更加迫切。

近年来中药复方在治疗慢性肾脏病方面发挥着了独特的优势,很多在西药难以控制的肾脏疾病在运用中医辨证治疗后,患者临床症状均得到了明显的改善。同时中医复方还能在一定程度上减少肾病患者服用激素或者免疫抑制剂等西药时引起的并发症,改善了患者生活质量,因此中医复方越来越得到大家关注和重视,肾间质纤维化的病名在我国古籍中并无记载,根据其特有的病理表现,可归属于中医“水肿”、“癃闭”、“关格”、“癥瘕”、“虚劳”等范畴。其总体的病机为本虚标实,本虚中的脾肾虚损和标实中的湿热、瘀血、浊毒是病机中的重要环节,前者是导致疾病发生、发展的病理基础,后者则为疾病持续发展的重要原因。

目前中医药在防治肾间质纤维化方面已有大量的实验研究,发现许多中医复方均具有抗肾纤维化的作用。现将近5年中药复方治疗肾间质纤维化的相关重要机制简单介绍如下。

1 抑制细胞外基质(ECM)过度沉积

ECM的主要成分为胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、纤维连接蛋白(FN)以及层黏连蛋白(LN),肾脏中ECM主要来源于成纤维细胞和肌成纤维细胞(MF)[2],在肾间质纤维化的肾脏中可检测出大量的MF。成纤维细胞生理状态下只产生少量的ECM,只有在受到炎症等细胞因子刺激后转化为MF,MF产生大量的胶原以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),使肾脏中ECM过度沉积,破坏正常的肾脏结构。吴小燕等[3]以清化固肾排毒颗粒(黄芪、柴胡、白花蛇舌草、山药、金钱草、大黄、白芥子)进行实验研究,发现UUO大鼠ECM沉积减少,COL4、FN阳性表达显著下降,肾纤维化程度缓解,证实清化固肾排毒颗粒可通过下调COL4、FN的表达而达到改善肾纤维化的作用。朱苗蕊等[4]以HK-2细胞为研究对象,发现高糖诱导后ECM显著增加,新加糖肾康(黄芪、生地黄等)干预后能够通过抑制ECM成分ColⅠ、Col Ⅲ、FN的分泌而防治DN间质纤维化。吕雁等[5]研究发现益肾化瘀方(黄芪、菟丝子、制大黄、丹参、莪术)可明显降低BUN、Scr,减少胶原生成,减轻肾小管损伤,证实益肾化瘀方可减少胶原生成,减缓肾间质纤维化。

2 促进细胞外基质(ECM)降解

基质金属蛋白酶系统(MMPs/TIMPs)失衡是ECM降解减少的重要原因,基质金属蛋白酶(MMPs)对于ECM具有很强的降解力,当MMPs被基质金属蛋白酶抑制物(TIMPs)阻断活性时,ECM无法被及时降解,同样也会导致ECM的过度沉积,加剧肾间质纤维化。张琳琪等[6]研究发现益肾化瘀方(黄芪、菟丝子、制大黄、丹参、莪术)可降低UUO大鼠TIMP-1mRNA水平以及纤维化程度,可通过平衡基质金属蛋白酶系统MMP-1/TIMP-1,促进细胞外基质成分的降解从而起到保护肾脏的作用。张新志等[7]研究证明抗纤灵冲剂(制大黄、桃仁、当归、丹参、牛膝)发挥抗肾间质纤维化的作用可能与MMP-9下调COL4α3基因及Col-Ⅳ蛋白表达,促进ECM降解来实现的。

3 调控纤维化因子及信号通路表达

3.1 调控TGF-β水平及相关因子表达 转化生长因子(TGF-β)是肾间质纤维化进程中不可缺少的因子,TGF-β有三个亚型,其中 TGF-β1致纤维化作用最为显著,不仅可以刺激成纤维细胞的活化,产生大量的胶原蛋白、FN、LN等加速ECM的沉积,同时抑制基质金属蛋白酶活化,减少ECM的降解,使ECM合成和降解失衡,中药复方也常将其作为治疗RIF的关键靶点。魏晓露等[8]研究发现扶肾降浊方(山茱萸、生黄芪、白花蛇舌草、丹参、鬼箭羽、益母草)可明显减少BUN、SCr、24hUPr,减轻肾组织病理损伤,降低TGF-β1和ColⅠ蛋白表达,升高HGF蛋白表达。证实扶肾降浊方可通过抑制TGF-β1和ColⅠ蛋白表达,促进HGF蛋白的升高,减少肾小管间质损伤而抑制肾间质纤维化。另有研究以阿霉素肾病大鼠为研究对象,证实补益脾肾方(黄芪、山茱萸、白术、三七、川芎)[9]通过调节TGF-β1和HGF表达,减缓肾间质纤维化。强胜等[10]研究证实固本泄浊饮(黄芪、蚕沙、首乌、党参、生大黄等)可减少5/6肾切除大鼠中Scr、BUN含量,可通过下调TGF-β1,上调BMP-7蛋白表达,来延缓肾衰大鼠肾间质纤维化进展。栗睿等[11]以腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠为研究对象,益肾排毒方(黄芪、土茯苓、当归、茯苓、大黄等)干预8周后,发现各治疗组TGF-β1、ColⅣ较模型组降低,证实益肾排毒中药复方具有改善及延缓腺嘌呤导致肾衰竭大鼠的肾间质纤维化的作用。

TGF-β1是强效的诱导剂,在间充质基因表达过程中发挥重要作用,能够促使肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(EMT),进而增加间充质细胞标志蛋白α-SMA的表达,减少上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达[12]。Zhu等[13]研究证明祛菀陈莝方(丹参、大黄、牡丹皮、茯苓等)使UUO大鼠TGF-β1、α-SMA、E-cadherin显著降低,可通过调节TGF-β1、E-cadherin等信号的表达,下调α-SMA水平,阻止肾纤维化的进展。

TGF-β还可以活化信号通路,其中Smad 信号传导与RIF联系最为密切。TGF-β可以磷酸化Smad2和Smad3使其活化,促进纤维化进程,而Smad7作为抑制型信号分子可以与Smad2、Smad3竞争受体,抑制纤维化进程。近年来,大量研究也证实了中药复方可通过下调TGF-β表达,抑制信号通路活化,从而减缓肾间质纤维化。Chen等[14]实验研究证实参芪丸(地黄、丹皮、山茱萸、茯苓、山药、泽泻等)可通过上调 Smad7,抑制 p-Smad2/3 的 mRNA和蛋白质表达,从而抑制TGF-β1/Smads信号通路,减少腺嘌呤大鼠中Scr、BUN、U-pro/24 h,减缓肾间质纤维化。Jiang等[15]以右肾切除的SD大鼠为研究对象,发现抗纤灵(丹参、大枣、牛膝、桃仁、淫羊藿)可降低BUN、Scr、24 h尿蛋白、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Col1a1、Col1a2和FN表达水平以及胶原纤维成分和间质细胞浸润程度,证实抗纤灵可下调TGF-β/Smad传导通路,发挥抗纤维化作用。陈宇等[16]研究发现清化固肾排毒方(黄芪、山药、金钱草、大黄、白芥子)可下调Smad2/3及上调Smad7来抑制TGF-β1/Smads传导通路起到延缓肾间质纤维化的作用。程涛等[17]以高糖环境诱导的HK-2细胞为研究对象,发现新加糖肾康(黄芪、生地黄等)能够显著减少TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白的表达,证实新加糖肾康能可以下调TGF-β/Smads信号通路起到减轻DN间质纤维化的作用。

3.2 调控 Wnt信号通路 有研究表明[18-20],很多不同的肾损伤类型都能发现Wnt/β-catenin 信号通路的表达,是引发肾损伤的重要信号通路。Wnt/β-catenin 信号通路可持续激活成纤维细胞,刺激多种炎症因子表达,从而导致ECM大量沉积以及EMT,中药复方可通过阻断该信号通路因子的表达,缓解RIF。林文博等[21]研究发现肾病I号方(柴胡、黄芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝莲等)可使UUO大鼠24hUP、Scr、BUN以及wnt4、β-catenin表达减少,胶原组织减少,证实肾病I号方发挥抗肾间质纤维化的作用可通过下调Wnt4和β-catenin的表达来实现。马飞等[22]以UUO大鼠为研究对象,证实肾衰宁片可降低血CREA、BUN、尿mAlb水平,通过降低Wnt4和β-catenin表达减轻肾损伤,延缓肾间质纤维化。刘武[23]研究证实补肾消癥汤(黄芪、菟丝子、炒杜仲、淫羊藿、土鳖虫、酒大黄等)可明显降低UUO大鼠β-catenin、PAI-1蛋白表达,促进miRNA-139,MMP-7蛋白表达,证实建中补肾消癥汤可减缓肾间质纤维化,可能与干预miRNA-139表达从而调控Wnt/β-catenin信号通路相关。还有研究[24]证实健脾益肾方可在大鼠5/6 肾切除模型中上调E-cadherin的表达,并下调Wnt3a、α-SMA、β-catenin的表达,提供了健脾益肾中药复方可以通过抑制Wnt3a/β-catenin来调控上皮间充质转分化发挥抗纤维化作用。

3.3 调控PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路与转化生长因子(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)等促纤维化因子联系密切[25],且PI3K/Akt信号通路可诱导单核/巨噬细胞浸润,促进炎性因子的表达。有研究表明,PI3K/Akt信号通路的激活本身即可介导足细胞的损伤,即肾小球脏层上皮细胞结构和功能破坏,进而导致蛋白尿的出现[26]。杨婧等[27]以5/6肾切除大鼠为研究对象,肾衰Ⅱ号方(大黄、桃仁、川芎、党参、丹参等)干预60天后发现用药组大鼠Scr、BUN显著减少,Ccr、Hb明显增多,纤维化明显减轻,p-Akt/pan Akt比值明显降低,证实肾衰Ⅱ号方可通过下调PI3K/Akt信号通路的表达而减轻肾间质纤维化。张艺伟等[28]研究表明参地补肾胶囊(人参、熟地、大黄、白术、茯苓、甘草等)可通过降低UUO大鼠PI3K/AKT信号通路的表达,从而延缓肾间质纤维化进程。Luo等[29]研究证明,大黄黄芪汤(大黄、黄芪)可显著降低UUO大鼠Scr、BUN以及PI3K、Akt、TGF-β1、α-SMA、IL-6的表达,肾小管萎缩和坏死、间质纤维化、细胞外基质增生和异常沉积明显减轻,证实大黄黄芪汤可以潜在地调节PI3K/Akt信号通路,减少胶原沉积,延缓肾间质纤维化进一步加重。

3.4 调控SHH信号通路 SHH信号通路在RIF进程中发挥着重要作用,可诱导TGF-β1释放,且SHH信号通路上调 Glil、Snaill 的表达,可促进EMT。Li等[30]以UUO大鼠为研究对象,发现肾衰灵方(大黄、龙骨、牡蛎、党参、丹参、蒲公英等)可显著降低UUO大鼠SCr、BUN,下调Gli1、snail1、Collagen I、α-SMA表达。证实肾衰灵方可抑制SHH-Gli1-snail1 信号通路的激活,降低纤维化细胞增殖,延缓肾间质进一步纤维化。

4 抑制血管紧张素系统活性

AngⅡ在RIF肾间质中的浓度高于血浆浓度几十倍,AngⅡ可通过诱导成纤维细胞向MF转化以及增加促纤维化因子(TGF-β1、CTGF等)表达,产生大量的ECM,促进间质细胞增生,同时还可以通过RASS系统影响水、电解质平衡以及肾脏血流动力造成不可逆的肾损伤。郭兆安等[31]实验研究以切除右肾联合注射链脲佐菌素的糖尿病肾脏病大鼠为研究对象,芪蛭降糖胶囊(黄芪、水蛭、黄精、黄芪、生地黄)干预12周后发现,芪蛭降糖胶囊用药组Scr、24hUPQ、α1-MG、β2-MG、AngⅡ、ET-1BS、GSI、IF、TGF-β1明显减少,NO显著增高,证实芪蛭降糖胶囊可以通过抑制血管紧张素Ⅱ的分泌,从而减少TGF-β1表达,改善肾小球硬化,发挥抗纤维化作用。

5 抑制炎症细胞相关因子表达

在受到炎性因子刺激时,上皮细胞、单核/巨噬细胞可产生大量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α),TNF-α能促进巨噬细胞浸润至受损的肾间质,并诱导巨噬细胞的促纤维化因子释放增加,加剧肾间质的炎症反应,引起成纤维细胞增殖及胶原的沉积[32]。张喜奎等[33]以桃核承气汤(桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝)进行实验研究,干预8周后,证实桃核承气汤改善肾间质纤维化与抑制炎症因子CRP、TNF-α、IL-6表达有关。祝婷婷等[34]研究发现肾衰Ⅱ号方(大黄、桃仁、川芎、党参、丹参等)可显著降低5/6肾切除大鼠SCr、BUN、TNF-α的表达,减轻纤维化程度,减少炎性细胞的浸润,证实肾衰Ⅱ号方可抑制促炎症细胞因子TNF-α的表达,改善肾功能,减缓肾间质纤维化。强胜等[35]研究证实益气养阴通络方(太子参、海风藤、鸡血藤、炙黄芪、熟地等)发挥抗肾间质纤维化作用与抑制IgA肾病大鼠TNF-α表达有关,可减少血尿、蛋白尿,减轻肾小球系膜基质增生。

有研究表明[36-38]阻断NLPR3炎症小体活化,可明显缓解肾脏炎症的发展。NLPR3炎症小体活化后,可激活白细胞介素IL-1β、IL-18,进而加重炎症反应,加快RIF进程。Wang等[39]研究发现,当归补血汤(黄芪、当归)可显著减少UUO大鼠α-SMA、NLRP3、pro-caspase-1、白细胞介素-1β的前体、白细胞介素-1β,小管中间质损伤明显减轻,间质胶原沉积明显减少。证实当归补血汤在UUO模型大鼠中起到了延缓间质纤维化的作用,与抑制NLRP3炎性体表达和减少细胞因子白细胞介素-1β的分泌有关。

6 抗氧化应激

氧化应激反应在RIF发生发展过程中占据重要地位,氧化应激是机体氧化/抗氧化系统失衡,导致活性氧(ROS)大量产生,引起组织产生不同程度的损伤。ROS的异常增多,可以促进TGF-β1等促纤维化因子表达,产生大量的ECM,同时可以直接攻击肾脏各类细胞,造成细胞的坏死、凋亡。ROS也可以活化NF-κB 等信号通路,从而诱导纤维化以及炎症等相关细胞、因子大量表达,加剧RIF的进展。Jin等[40]研究表明清肾颗粒(白花蛇舌草、薏苡仁、黄连、黄连、大黄、益母草等)干预4周后,可明显降低UUO大鼠Scr、ROS、MDA、α-SMA,NF-κB 信号通路相关蛋白ICAM-1、MCP-1、NF-KBp65、p-IKBα、IKKα的表达减少,肾间质纤维化得到明显延缓,肾小管损伤明显减轻,表明氧化应激NF-κB信号通路有助于U肾间质纤维化的形成。证实清肾颗粒可通过抑制氧化应激NF-κB信号通路、减少炎症来预防RIF。Yuan等[41]以氯化汞诱导的SD大鼠为研究对象,扶正化瘀方(天花粉、绞股蓝、桃仁等)可减少Hyp含量和胶原沉积,显著增加GSH含量,降低NF-κB活性、MMP-2活性、p-IκB、TNF-α、MDA及α-SMA表达,证实了扶正化瘀方可以改善氯化汞诱导的肾间质纤维化的氧化损伤,并通过抑制IκB磷酸化拮抗氧化应激刺激的NF-κB活性,从而起到延缓肾间质纤维化的作用。Yang等[42]以缺氧诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)进行体外分析,发现肾衰Ⅱ号方可减少FN 和 COL-I的表达,证实肾衰Ⅱ号方对肾脏保护作用可能与抑制缺氧有关,可以安全有效地减少细胞外基质产生以减缓肾间质纤维化。还有研究[43]证实通络益肾汤(丹参、柴胡、红花、菊花)通过抑制NLRP3介导的细胞焦亡来减轻缺氧诱导的NRK-52E细胞损伤,可以起到阻断肾纤维化进一步进展的结果。

7 调节线粒体功能

线粒体是细胞生成三磷酸腺苷(ATP)的场所,是机体供能的来源所在。众多研究表明[44-45],线粒体功能障碍是肾小管上皮细胞损伤的主要特征,在肾脏损伤持续进展过程中发挥重要作用。RIF进程中伴随着水、电解质、酸碱平衡紊乱,线粒体结构和功能受到细胞环境影响,融合与裂变的平衡被打破,生成ATP减少,释放大量的炎性因子,合成过量的ROS不仅会增加氧化应激反应,也会直接攻击线粒体的核酸、酶类等,导致线粒体功能障碍加剧,生成更多的ROS,加重肾损伤,加速ECM沉积。随着的发生发展RIF,肾单位也随之遭到越来越多的破坏,机体则需要更多的ATP提供能量。线粒体功能障碍,ATP合成不足会加剧纤维化进程,中药复方可通过恢复线粒体裂变/融合平衡,改善线粒体功能以缓解RIF患者病情。Liu等[46]研究发现健脾益肾方(黄芪、白术、肉苁蓉、白豆蔻、丹参、大黄、甘草等)可明显减少5/6肾切除大鼠Scr、BUN、尿蛋白及纤维标志物纤连蛋白、IV型胶原蛋白α-SMA,上调线粒体呼吸复合物的亚单位,增加PGC-1α(线粒体生物发生的主要调节因子)及其下游信号 NRF-1 和 TFAM的表达,从而恢复PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,从而抑制Drp-1 的上调和 Mfn-2 和 OPA-1 的下调来增加线粒体的融合、减少裂变,肾小球肥大、肾间质纤维化在病理结果中显现明显减轻。证实健脾益肾方可通过调节线粒体质量控制网络减轻肾结构损伤,保护肾功能,减缓间质纤维化。Liu等[47]另一项实验研究证实治疗健脾益肾方可降低Scr、BUN 以及FN、Col-IV、α-SMA蛋白表达,促进 QPRT/NAD+/SIRT3 信号并恢复线粒体裂变/融合平衡,减轻肾间质纤维化水平。黄芪丹参汤(黄芪、丹参)在实验研究[48]中也被证实可减少线粒体分裂的主要调节因子Drp-1、Mid 51和Mid 49表达,促进Mfn-2表达和抑制OPA-1水解来恢复线粒体动力学,调节线粒体裂变/融合平衡,从而改善肾小管萎缩和间质纤维化。Wang等[49]实验研究也证实了肾衰Ⅱ号方上调PGC-1α蛋白表达,改善线粒体形态和功能,抑制mtROS的产生以保护肾功能,延缓纤维化。

8 小结

综上所述,不难发现中药复方对于抗肾间质纤维化的实验研究机制多集中于抑制ECM过度沉积、抑制炎性因子表达、抗氧化应激以及近年新兴热点——调节线粒体的相关功能,对于信号通路多集中于TGF-β1所介导的信号通路及因子表达。RIF是多种因素共同影响的动态病理改变,除了本文所涉及的TGF-β1、Wnt、NF-κB、PI3K/Akt以及SHH信号通路外,还有Notch、JAK/STAT多种信号通路和分子相互作用、协同调控RIF。因此,RIF的影响机制是中药复方治疗RIF,保护肾功能的重要靶点。上述研究发现,中药复方在防治RIF的多环节都发挥了重要作用,中医认为RIF的病机不外乎脾肾亏虚为本,湿热、瘀血、浊毒为标,中药复方在组方时也本着补肾健脾、利湿泄浊、活血通络的治疗原则,多使用黄芪、茯苓、枸杞、川芎、大黄、丹参等中药进行组方配伍。大量的研究表明[50],这些中药具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纤维化等现代药理学作用,这恰好与RIF的发病机制相符。在上述研究中,同一中药复方在治疗RIF具有多种作用靶点,不同的中药复方也可以抑制同一种机制,例如:肾衰Ⅱ号方可通过抑制PI3K/AKT信号通路活化[26]、下调促炎症细胞因子TNF-α的表达[34]、抑制氧化应激反应[42]以及改善线粒体形态和功能[49]等多条途径延缓RIF进程,参芪丸[14]、抗纤灵[15]、清化固肾排毒方[16]以及新加糖肾康[17]等多个中药复方都可抑制TGF-β/Smad信号传导通路活化,从而发挥抗纤维化的作用。这与中医辨证论治以及各中药相配伍,发挥其有效成分的作用息息相关。然而目前中药复方对于单一机制之间尚缺乏串联整合,在阻断发病机制方面的各项研究尚且不够深入[51]。虽然大量的实验研究已经表明,中药复方在组织、细胞、蛋白、基因等水平防治肾间质纤维化具有良好的效果,但由于中药成分的复杂性,多种中药配伍而成的中药复方其成分更为复杂。因此,对于中药复方及单味药有效成分进行深入研究,剖析中药复方如何多靶点、多层次、多环节的发挥抗肾间质纤维化作用,同时与现代科学相融合,为中药复方在药物、药量等配伍组方提供更明确的依据,以期研发更多具有针对性、疗效明确的临床中药制剂。