特医食品中VC检测关键控制点及稳定性研究

范春婷，殷耀，张萍，陆慧媛*，张晓燕，沈伟健

南京海关动植物与食品检测中心（南京 210019）

维生素C（Vitamin C，VC）作为特殊医学用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，FSMP）（以下简称特医食品）中重要的营养元素，具有促进抗体形成、促进铁吸收、清除自由基等功能[1]*。但因其对光、热、氧等极不稳定的特性[2]*，使得快速、准确测定特医产品中VC的含量成为行业难点。根据现行国家标准[3]*，特医食品中VC的检测方法GB 5413.18—2010[4]*存在前处理过程过滤困难、滤液不澄清等缺点[5]*。目前，VC检测方法还有二氯靛酚滴定法[6-7]*、紫外分光光度法[8-10]*和高效液相色谱法[11-12]*。GB 5009.86—2016[13]*包含了除荧光法之外的3种方法，但此标准适用范围也不包含特医食品，且前处理过程因特医食品富含蛋白质的特性，影响定量。食品及药品中VC的稳定性一直备受关注[14-17]*，但目前未见关于特医食品尤其是特医食品液态产品中VC稳定性的研究。因此，研究并掌握特医食品中VC的降解规律，找到可有效保持其稳定的方法成为特医食品研发、生产过程中的一个重要环节。

此次研究对GB 5009.86—2016[13]*的液相色谱法进行优化，将蛋白沉淀作为前处理的关键控制点，建立回收率稳定且更适于特医食品VC的测定方法；并对特医食品液态产品中的VC进行稳定性考察，为特医食品中VC的检测和研发提供技术保障及参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；SQP Quintix224-1 cn电子天平（德国赛多利斯公司）；Sigma2-16K台式冷冻离心机（德国Sigma公司）。

维生素C标准品（纯度99.98%，Sigma Aldrich）；磷酸、偏磷酸、乙酸锌、磷酸二氢钾，均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇，色谱纯（美国 默克公司）。

所有特医食品样品均来源于南京海关动植物与食品检测中心送检的委托样品。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

维生素C标准溶液配制（现配现用）：称取0.01 g（精确至0.000 1 g）维生素C标准品于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g/L）溶解并定容。

偏磷酸溶液：称取20 g（精确至0.1 g）偏磷酸，溶于水并稀释至1 L。

200 g/L乙酸锌溶液：称取200 g（精确至0.1 g）乙酸锌，加入水溶解至1 L。

1.2.2 样品前处理

称取2 g（精确至0.001 g）样品于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 200 g/L乙酸锌溶液，加入20 g/L偏磷酸溶液震摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50 mL离心管中，超声提取5 min后，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm水相膜，待分析。

1.2.3 色谱条件

仪器及色谱条件参考GB 5009.86—2016[13]*第一法高效液相色谱法6.4仪器参考条件。

1.3 特医食品中VC稳定性研究

依据《特殊医学用途配方食品稳定性研究要求（试行）》（2017版）的相关规定，选取不同特医食品液态样品，对其贮藏过程中VC含量的稳定性进行跟踪试验。

1.3.1 加速、长期和影响因素试验

将样品分别存放于不同药品稳定性试验箱中（已通过相应温湿度检定），进行加速试验和长期试验，温、湿度分别为30±2 ℃，Hr60%±5%和25±2 ℃，Hr60%±10%。影响因素考察高温和高湿条件，条件分别为40 ℃，60 ℃和光照4 500 Lx±500 Lx。加速试验于第0，第1，第2，第3，第4和第5个月取出检测，长期试验于第0，第3，第6，第9，第12和第15个月取出检测，影响因素于第5天和第10天取出检测。

1.3.2 使用中稳定性试验

将样品开封后，放置1 min，盖上盖子分别置于4～8 ℃或25±2 ℃条件下存放24 h，然后检测。

1.4 数据处理

检测数据、色谱图、标准曲线图采用液相色谱仪自带工作站的数据分析软件处理，表格及图像数据统计分析用Excel 2019及Origin 8.5处理。

2 结果与讨论

2.1 维生素C标准物质分析

参照GB 5009.86—2016[13]*第一法，采用液相色谱仪对维生素C标准溶液进行分析，结果显示，目标物在8.4 min出峰，峰形尖锐，总分析时长13 min，在0.5～50 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y=88.704 98X，相关系数0.999 96（详见图1）。按3倍信噪比确定此方法检出限为0.5 mg/100 g，10倍信噪比确定定量限为2 mg/100 g。

图1 维生素C液相色谱图及标准曲线

2.2 蛋白沉淀剂的选择

拟在GB 5009.86—2016[13]*第一法的基础上，增加蛋白沉淀步骤。常用的蛋白沉淀剂包括金属盐、有机溶剂等[18]*。其中，乙醇可以使蛋白质和溶剂分子之间的相互作用减弱，使蛋白质发生聚集而沉淀[19]*；乙酸锌可以通过降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出[20]*。研究比较无水乙醇和乙酸锌对样品中蛋白质的沉淀效果。结果显示，无水乙醇含量达50%时沉淀效果较好，但此时色谱峰变宽，峰形差（详见图2a），且回收率仅70%左右，经分析可能是提取液中较高含量的乙醇使VC在色谱柱上的保留性变差导致的；而乙酸锌既可以很好地沉淀蛋白，又不会影响VC在色谱柱上的保留性，色谱峰对称且尖锐（图2b）。

图2 样品及维生素C标准溶液色谱图

基于上述结果，对乙酸锌的最佳使用量进行摸索。固态基质样品分别加入0.2，0.4和0.8 g乙酸锌，液态基质样品分别加入0.1，0.2和0.3 g乙酸锌。结果表明，固态基质样品中，0.2 g乙酸锌蛋白沉淀效果较差，提取离心后样品溶液仍浑浊（图3a），0.4 g和0.8 g乙酸锌可以获得较清澈的样品溶液（图3b，图3c），本着节约试剂的原则，选择0.4 g乙酸锌作为特医食品固态基质样品蛋白沉淀剂；而0.1 g乙酸锌固体即可在液态基质样品中达到较好沉淀效果（图4a），故选择0.1 g乙酸锌作为液态基质样品蛋白沉淀剂。

图3 固态基质特医食品乙酸锌蛋白沉淀效果

图4 液态基质特医食品乙酸锌蛋白沉淀效果

为进一步提升可操作性，研究将乙酸锌固体配制成200 g/L乙酸锌溶液。将样品用偏磷酸溶液溶解后，分别加入2 mL（固态样品）、0.5 mL（液态样品），处理后的样品详见图5。试验发现可以较好地完成过滤和后续检测。

图5 乙酸锌溶液蛋白沉淀效果

2.3 不同特医食品样品加标回收试验

为验证优化后方法的准确性，选取特医食品液态及固态基质样品共24个，进行加标回收试验。结果显示，液态基质特医食品加标回收率范围95.6%～104.2%，固态基质特医食品加标回收率范围95.9%～102.2%（详见表1），均符合GB/T 27417[21]*的要求，表明此方法重复性较好，可用于液态和固态特医食品的检测。

表1 不同基质特医食品维生素C加标回收试验结果

2.4 维生素C稳定性试验

2.4.1 加速和长期试验中维生素C稳定性

随机选取3个特殊医学用途全营养配方食品液态基质产品进行加速和长期稳定性试验，对VC的稳定性进行跟踪检测。每瓶样品在检测前均处于密封状态，一旦开瓶，立即进行检测。结果显示，经5个月加速试验和15个月长期试验后，VC含量均明显降低（图6，图7），衰减率分别为30.6%～80.3%和30.0%～78.4%；长期试验中，VC含量的降低在前3个月最为明显，衰减率为18.3%～31.0%；第9～第15个月下降趋势逐渐趋于平缓，衰减率仅为3.4%～4.3%。经分析，可能与样品中存在残氧量有关，初期VC氧化较快，随时间延长残氧剩余量减少，VC相对稳定。

图6 加速试验维生素C含量变化

图7 长期试验维生素C含量变化

2.4.2 高温试验中维生素C的稳定性

高温试验结果表明，温度对特医食品贮藏过程中VC的稳定性影响较大，在40 ℃或60 ℃保存10 d，VC的衰减率分别为12.1%～18.2%和36.4%～43.6%（图8和图9），且温度越高，衰减越快，如60 ℃保存5 d，VC衰减率高达22.5%。这个结果与Guerra-Hernandez等[22]*的发现一致，即婴幼儿液态奶在55 ℃储藏90 d VC的含量远低于在20 ℃下储存的产品。

图8 高温试验40 ℃维生素C含量变化

图9 高温试验60 ℃维生素C含量变化

2.4.3 光照试验中维生素C的稳定性

选择实验室现有的两种包装材质，分析不同透光率的包材在特医食品中VC受光照影响中的作用，包装材质如图10所示，特医食品D使用不透光材质进行包装，特医食品E、F使用透光材质进行包装。结果显示，在4 500 Lx±500 Lx照度下的第5天和第10天（图11），不透光材质瓶装的特医食品D衰减率分别为0.96%和7.00%，而透光瓶装特医食品E、F中VC的衰减率分别为7.95%，12.55%和15.89%，14.67%，由此可见光照对产品中VC的稳定性与包材的透光性有很大关系。这一结果与阎然等[23]*的结果一致，即光照会降低NFC鲜榨橙汁中VC浓度，避光则显著减少VC的损失。另有研究表明光线会加速VC的降解，其降解反应速率符合一级反应模型[24]*，且自然日光的照射比日光灯的照射损失更快[2]*。

图10 不透光和透光包装材质示例

图11 光照试验维生素C含量变化

2.4.4 使用中稳定性试验维生素C的含量变化及保持其稳定性方式确认

结果显示，样品开封后，无论常温或冷藏条件下特医食品F中VC含量下降均很快，衰减率分别为18.1%和19.0%，经分析，可能与样品开封后空气进入瓶中，导致VC发生氧化和降解有关，而与空气的影响比较，不同贮藏的温度条件对VC含量的影响不明显。王亚楠等[25]*也发现菠菜汁中VC保存率与空气暴露时间的长短有很大关系，暴露时间越长，VC保存率越低。在氧气作用下，L-抗坏血酸极易被氧化为L-脱氢抗坏血酸，从而导致VC含量的衰减，这与Renner[26]*的研究结果一致，当UHT乳中氧含量达到8～9 mg/L，28 d后UHT乳中VC的损失率达100%。

图12 使用中稳定性试验维生素C含量变化

为确认样品中残氧及开瓶后产品中空气进入对样品中VC稳定性的影响，随机取一瓶特医食品液态样品，首次开瓶进行检测后立即充入高纯氮气（纯度＞99.999%），密封后冷藏保存，分别于不同时间进行检测，且在每次检测后都充入氮气保存，结果发现，样品中VC含量在3个月内仅下降2.79%，具体数据详表2。此结果进一步证实样品中VC的衰减与样品中残留空气有关。

表2 充入氮气保存特医食品样品后维生素C含量的变化结果

3 结论

研究根据特殊医学用途配方食品的基质特性，确定了特殊医学用途配方食品中VC检测的关键控制点，利用蛋白沉淀剂净化样品，C18色谱柱分离，紫外检测器定量，建立了一种可准确检测特殊医学用途配方食品中VC含量的高效液相色谱检测法。经实际样品检测，该方法稳定、准确、高效。同时，对特殊医学用途配方食品贮藏过程中VC的稳定性考察结果表明，储存温度、光照、包材避光性及样品瓶中残留的空气均可对样品中的VC造成影响，因此在特医食品的研发、生产以及储存过程中均应选择低温、避光场所，并采用隔氧、避光的包装材料，以保证产品中VC的稳定。