猪肉中雄烯酮含量不同对小鼠性腺组织及性激素水平的影响

许烁熙，刘嘉莹，李育银，梁晓文，章力建，侯少贞*

1. 广州中医药大学中药学院（广州 510006）；2. 广州市仙草家园科技有限公司（广州 510799）；3. 国家农产品质量安全风险评估专家委员会（北京 100125）

肉类食品是人类饮食重要的营养物质，猪肉是我国主要的动物性食品，对人们生活水平具有极其重要影响。猪肉中含有人体各种必需氨基酸，其必需氨基酸的构成比例接近人体需要，可被人体充分吸收，属于优质蛋白质[1-2]*。猪肉中含有丰富的钙、镁、磷、钠、钾、氯等微量元素。其中，钙、磷是影响骨骼发育的营养要素；铁元素是合成血红蛋白所不可缺少的，同时也是维持人体正常生命活动最重要的十几种酶的组成要素；钠、氯等元素，可充分补充有机体消耗的盐分[3-6]*。因此，这些指标是猪肉质量评价重要依据。

在猪肉质量评价中，风味是一种重要的评价指标。猪肉在烹饪时会产生膻味，这主要是由雄烯酮及粪臭素过度累积造成[7-9]*。粪臭素是大肠内厌氧微生物降解色氨酸的产物，有极强的粪臭味[10]*。雄烯酮又叫猪烯酮，是公猪睾丸中产生的一项类固醇激素，属于16-雄甾烯类固醇家族，具有尿骚味，易储存于肌肉及口水中，作为信息素刺激母猪发情以促进交配，且在母猪中也少量存在，这是猪肉的主要骚味来源。雄烯酮在睾丸中与类固醇激素、雄激素和雌激素一同形成，连同其他16-雄甾类固醇激素，由睾丸中孕烯酮合成[11-14]*。有研究表明，睾丸类固醇，雄激素和雌激素含量增加的公猪具有较高的雄烯酮水平，雄烯酮与性发育程度相关。雄烯酮是公猪气味剂的主要成分，可用于测试母猪是否进入发情期或诱导母猪发情[15]*。

在猪体内，雄烯酮与雄激素、雌激素等的合成及代谢息息相关[16]*。但雄烯酮不仅存在于公猪的口水及脂肪中，还存在于人类的口水和汗腺中，是人类男性体味的一类化合物。已有研究支持雄烯酮传递优势、攻击及竞争的概念，并认为雄烯酮是社会合作意愿降低及婚外性行为可能性增加的信号[17-18]*。研究表明睾酮水平及雌二醇水平较高的患者对于雄烯酮的敏感程度更高[19]*，睾酮与雌二醇是影响人体性腺组织分泌的主要性激素。雄烯酮的产生与内源性睾酮水平密切相关，因此，推测雄烯酮可能能影响机体的性激素水平。

猪肉作为肉类食品中雄烯酮含量较高的一项肉类食品，其雄烯酮对于味蕾的影响已被广泛报导，然而食用雄烯酮含量偏高的猪肉后是否产生其他不良影响，尤其是对摄入者体内激素水平的影响，仍缺乏相关研究。因此，试验采用雄烯酮含量不同的猪肉对小鼠进行喂养，观察小鼠性激素水平和性腺组织的变化，以期初步探讨猪肉雄烯酮含量高低不同对机体性激素带来的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

昆明种小鼠[SPF级别，体重18～22 g，珠海百试通生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（粤）2020-0051，广州中医药大学动物中心饲养]；猪肉样品（市场随机采购猪前腿肉样品10份、广州仙草家园提供散养山猪前腿肉样品10份）；肝脏样品（市场随机购买猪肝新鲜猪肝样品10份、广州市仙草家园提供散养山猪猪肝样品10份）；猪雄烯酮（ADT）Elisa试剂盒（BS-E14469O1，江苏博深生物科技有限公司）；小鼠睾酮（T）Elisa试剂盒（RXJ202921M）、小鼠雌二醇（E2）Elisa试剂盒（RXJ203008M）（泉州睿信生物科技有限公司）；小鼠粪臭素（Ska）Elisa试剂盒（ZK-P9738，深圳子科生物科技有限公司）；BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒（MA0082-3，大连美仑生物技术有限公司）。

1.1.2 仪器

1510型全波长酶标仪、HP300型组织脱水机、HBM-1型组织包埋机、TM-4000型组织切片机（美国Thermo Fisher公司）；HF-24M型全自动样品冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；CKX-41-32型倒置型显微镜（日本Olympus公司）；CM-24-11型光学显微镜（日本Olympus公司）；LGJ-60A型冷冻干燥机（上海豫明仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 猪肉及肝脏中粪臭素及雄烯酮含量检测

从每份样品中取适量猪肉或者猪肝，按1∶9比例加入生理盐水，匀浆后离心取上清，使用蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度，并将蛋白浓度调节至一致，按照雄烯酮及粪臭素试剂盒检测说明书检测猪肉及猪肝样品中雄烯酮及粪臭素含量。

1.2.2 猪肉样品制备

将市售猪肉和天下农王提供的猪肉分别用清水洗净，放入锅中加清水煮熟，捞出，用吸水纸擦干表面水分，切成等量小块，放入冷冻干燥机中干燥至恒重，取出，密封袋密封，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 动物模型建立、分组及给药方法

将60只雄性小鼠和60只雌性小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，雌雄各半，分别为：空白组、低雄烯酮猪肉喂养组（低、高投喂剂量组设为5和10 g/kg组）、高雄烯酮猪肉喂养组（低、高投喂剂量组设为5和10 g/kg组）。动物每12 h光照，相对湿度50%～80%，给予普通饲料，纯水，进行普通饲养。动物每天给予定量的普通饲料，雄烯酮猪肉喂养组按供试量及体重每天给予一定量冻干猪肉以替代等量普通饲料；连续投喂8周。

1.2.4 小鼠血清睾酮及雌二醇

8周后，小鼠禁食过夜；隔天早上麻醉，以含有EDTA之真空采血管自下腔静脉采血后。随后动物进一步麻醉处死，解剖取雌鼠子宫、卵巢；雄鼠睾丸及前列腺精密称重。采用Elisa剂盒测定雄性小鼠血清睾酮、雌性小鼠雌二醇水平。

1.2.5 卵巢、子宫及睾丸、前列腺组织病理学观察

动物采血后，进一步麻醉处死，解剖卵巢、子宫、睾丸及前列腺精密称重后，4%多聚甲醛溶液固定后用石蜡包埋，通过苏木精-伊红染色进行病理组织学检查。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0统计软件处理数据，结果均以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同来源猪肉及肝脏样品中雄烯酮、粪臭素含量

采用Elisa检测试剂盒检测2种不同来源猪肉及猪肝中雄烯酮含量，结果如图1所示，与市场销售的相比，仙草家园供的猪肉及猪肝中雄烯酮含量显著性降低（P＜0.05）。图2显示，与市场销售组相比，仙草家园提供的猪肉样品中粪臭素含量显著性降低（P＜0.05）。

图1 不同来源猪肉及肝脏中雄烯酮含量

图2 不同来源猪肉及肝脏中粪臭素含量

2.2 不同来源猪肉对小鼠生长状态的影响

根据2.1结果，随机购买的市售猪肉样品雄烯酮含量更高，因此作为高雄烯酮含量猪肉样品进行喂养；仙草家园公司提供的猪肉样品雄烯酮含量偏低，列为低雄烯酮含量猪肉样品进行喂养。空白组小鼠给与常规试验鼠饲料、未进行任何饮食干预，其状态良好、活泼，毛发有光泽。各猪肉干预组在保证基础饮食供应的基础上，替换一定量猪肉样品进行饲喂。其中，高雄烯酮含量猪肉喂养组雄性小鼠饲养1周后开始出现部分动物有躁狂及攻击行为，表现为喜打架撕咬；将其中撕咬情况最为严重的雄性小鼠分离后，其余小鼠仍出现严重的撕咬状况，多数小鼠尾部及背部出现明显咬痕，个别动物甚至出现断尾、眼睛受伤等极端损伤现象；低雄烯酮猪肉喂养组小鼠与高雄烯酮猪肉喂养组组相比，撕咬状态明显缓解，喜打架撕咬小鼠分离后其他小鼠撕咬情况明显降低，与空白对照组无明显差异。

雌性动物喂养猪肉后未出现明显的异常行为或状态改变。

2.3 各组雄性小鼠睾丸及前列腺指数

如图3所示，与空白组比较，高雄烯酮及低雄烯酮猪肉喂养组喂养一定量猪肉后，小鼠睾丸指数及前列腺指数等没有显著性差异。

图3 各组小鼠睾丸及前列腺指数

2.4 各组雄性小鼠睾酮、雌性小鼠雌二醇含量

如图4所示，与空白组相比，经过高雄烯酮及低雄烯酮猪肉饲养后，雌鼠雌二醇水平有所降低，其中高雄烯酮猪肉喂养组（供试量10 g/kg）雌鼠雌二醇水平显著降低（P＜0.05），而雄鼠睾酮水平显著性增加（P＜0.01），低雄烯酮含量猪肉喂养组喂食后小鼠血清中睾酮及雌二醇水平均没有显著性差异。

图4 不同喂养组小鼠雌二醇、睾酮水平的比较

2.5 各组小鼠卵巢组织病理学

如图5所示，空白组小鼠卵巢皮质及髓质结构清晰，颗粒细胞排列整齐、层次多；高雄烯酮猪肉喂养组与空白组相比，有个例出现正常卵泡数量有所减少，闭锁卵泡较空白组有所增加；而低雄烯酮猪肉喂养组与空白组相比，个别动物有些许闭锁卵泡；整体上各组间形态结构差异不显著。

2.6 各组小鼠子宫组织病理学

如图6所示，小鼠子宫内膜腔上皮细胞呈柱状排列，表面有纤毛覆盖，间质疏松，呈蜕膜化改变，血管、腺体数量多，腺腔面积大。各组猪肉喂养后小鼠子宫与空白组相比无显著性差异。

2.7 各组小鼠睾丸组织病理学

如图7所示，空白组小鼠睾丸精小管排列紧密整齐，精管内生精细胞数量密集、分布均匀、形态良好；与空白组相比，个别高雄烯酮猪肉喂养组动物睾丸精管内生精细胞数量有所减少，而低雄烯酮猪肉喂养组与空白组相比无明显差异，睾丸精小管排列整齐，形精管内生精细胞数量密集、分布基本均匀，整体上各组间的组织形态差异不显著。

3 讨论

雄烯酮是猪的一种性费洛蒙，也是猪的膻味来源，有研究表明，雄烯酮在猪体内与雄激素及雌激素一起合成，而性激素对性腺组织的发育具有重要影响[13]*。因此推测雄烯酮可能对性腺组织产生一定影响。雄烯酮主要存在于猪肉脂肪中，通过猪肉摄入一定量雄烯酮是否会产生对激素水平的不良影响，尚无相关报道。

经检测，仙草家园提供的散养山猪猪肉样品与市场销售随机采猪肉购样品相比，其肌肉及肝脏中雄烯酮含量显著性降低。根据前期观察发现，仙草家园散养的雄猪发情的次数与其他常规饲养场的雄猪明显降低，这或许是与其体内雄烯酮含量不高有关。此外，经检测仙草家园提供的猪肉与市场销售猪肉相比其粪臭素含量显著性降低。综合2项指标，可以推测粪臭素、雄烯酮含量偏低是仙草家园猪肉风味更好的重要原因。

试验进一步考察雄烯酮含量不同的2种猪肉喂食后对小鼠性激素及性腺组织的影响。采用Elisa试剂盒检测雄性小鼠血清睾酮水平。与空白组相比，高雄烯酮猪肉喂养组小鼠的睾酮水平显著增加；且喂养后雄性小鼠出现一定的躁狂状况，随着饲养周期的逐渐增加，部分小鼠出现严重打架行为，这可能是因为睾酮水平的增高影响雄性小鼠，增加雄性小鼠的攻击性[20-21]*。低雄烯酮含量猪肉喂养后小鼠相比高雄烯酮含量猪肉喂养的小鼠，其打架行为明显缓解。其随着饲养周期的增加其躁狂状态变化不大。研究表明，雄烯酮可能会传递一种优势、攻击及竞争的概念，因此，推测雄烯酮水平过高可能会影响雄性小鼠的睾酮水平，导致小鼠出现躁狂状态，影响动物的相关性激素水平及动物状态。

同时，检测雄烯酮含量不同的2种猪肉喂食后雌鼠体内雌二醇水平。结果表明，经高雄烯酮猪肉喂养后雌鼠雌二醇水平可出现明显降低。这是因为食物中高雄烯酮摄入直接引起还是由其他物质引起的，需要后续试验进行研究及探索。

综上，试验发现市场销售猪肉及仙草家园提供的自然散养猪猪肉样品中的雄烯酮、粪臭素等含量有明显差异。除了引起膻味外，雄烯酮含量较高的猪肉样品还可能影响摄入动物小鼠的性激素水平，改变雄性动物行为。具体影响机制仍有待进一步研究。

雄烯酮是猪饲养过程中一种常用的刺激发情的激素。试验初步揭示高雄烯酮含量肉样对摄入动物性激素的影响，但其具体量效关系、时效关系考察还不全面，尤其是长期摄入是否会对性器官产生明显的不良影响，也有待进一步研究。