冻融单囊胚移植中囊胚内细胞团和滋养层评分对妊娠结局及新生儿出生结局的影响

伏海燕，李美玲，许娟娟，陈莉，李晓艳，林莹，周城，吴蓉花，王慧，黄梦婷，姚兵

(中国人民解放军东部战区总医院生殖医学科，南京 210002)

随着囊胚培养技术和体系的不断成熟和完善，囊胚移植在临床上得到广泛应用。囊胚培养跨过胚胎基因组激活阶段[1]，通过该阶段的自然选择，淘汰掉发育潜能较差的胚胎，有囊胚形成的胚胎往往具有较高的种植潜能[2]，以此提高胚胎的着床率和活产率[3-4]。与卵裂期胚胎相比，囊胚移植可显著提高临床妊娠率和活产率[5]。而相比于两枚囊胚的移植，单囊胚移植可以达到相似的临床妊娠率，且由于降低了移植胚胎的个数从而可以显著降低多胎妊娠的风险[6]。因此如何挑选出发育潜能最佳的囊胚用于移植，是单囊胚移植能否成功的关键因素之一。

目前筛选优质囊胚的方法主要还是依赖于Gardner形态性评价体系[7-8]，该体系主要指标是囊胚的扩张程度、内细胞团(ICM)质量和滋养层细胞(TE)质量。有研究发现ICM评级较TE评级对临床妊娠率和活产率有更高的预测价值，而囊胚不同发育速度和质量评级对新生儿结局无明显影响[9]。也有研究认为囊胚发育速度、ICM等级、TE等级及囊胚扩张程度均与整倍体胚胎复苏移植周期早期妊娠结局无明显相关性[10]。关于囊胚的发育速度和种植潜能的关系目前仍存在争议，有文献报道囊胚的发育速度对囊胚的种植潜能影响更为关键，其研究发现第5天(D5)形成的囊胚种植潜能高于D6形成囊胚组[11-12]；但也有不一致的观点，有研究发现D5优质囊胚移植后的临床妊娠结局与D6优质囊胚类似[13]。因此，本研究回顾性分析本中心行单囊胚冻融胚胎移植(FET)患者的临床资料，旨在探讨FET周期中不同的囊胚质量对临床结局和新生儿出生结局的影响，为临床实践中选择发育潜能最佳的囊胚进行移植提供依据。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2015年1月至2021年12月期间在本科室接受FET单囊胚移植患者的临床资料，共1 647个周期。

纳入标准：(1)患者年龄≤38岁；(2)行FET单囊胚移植；(3)促排卵方案为激素降调节方案。排除标准：(1)行胚胎植入前遗传学检测(PGT)的周期；(2)存在子宫畸形、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫内膜息肉等影响子宫内膜容受性的疾病；(3)促排卵方案为微刺激、自然周期、黄体期促排卵、高孕激素状态下促排卵方案等温和刺激方案；(4)供卵、供精周期；(5)行卵子冷冻的周期。

本研究中所有囊胚的扩张程度均为3～6期。根据囊胚ICM和TE评分级别进行分组：A组(移植AA级囊胚)231个周期；B组(移植AB/BA级囊胚)422个周期；C组(移植BB级囊胚)885个周期；D组(移植CB/BC级囊胚)109个周期。

二、研究方法

1.促排卵及体外受精：纳入本研究的所有患者均采用激素降调节方案促排卵。当主导卵泡平均直径≥18 mm时，予HCG(珠海丽珠医药)5 000～10 000 U扳机，36～38 h后采用超声引导下的卵泡穿刺术取卵。所有获得的卵母细胞均置于37℃、5%CO2、5%O2培养箱中培养。根据取卵日男方精液状况决定授精方式，处理后男方精子总数达到IVF加精标准的患者行IVF，男方因素不育或未达IVF加精标准的患者行ICSI。授精后4.5 h脱除卵母细胞颗粒细胞，确定卵母细胞成熟度和双极体(2PB)情况，若卵母细胞2PB数/MⅡ卵数≤30%，行补救ICSI(R-ICSI)；受精后16～18 h观察卵子受精情况。

2.胚胎培养和评级：胚胎置于37℃、5%CO2、5%O2培养箱中培养至第3天，观察胚胎的卵裂情况，并根据伊斯坦布尔共识[14]对卵裂期胚胎进行评分。细则如下：Ⅰ级(4分)：胚胎卵裂球等大，形态规则，胞质均匀清晰，碎片率少于10%；Ⅱ级(3分)：胚胎卵裂球大小不均，形态欠规则，碎片率10%～25%；Ⅲ级(2分)：胚胎卵裂球大小严重不均，形态欠规则，碎片率30%～50%；Ⅳ级(1分)：碎片率大于50%。Ⅰ～Ⅱ级卵裂期胚胎为优质胚胎，可以冷冻或移植；Ⅲ级卵裂期胚胎为非优质胚胎，可以继续培养至囊胚。

囊胚评估采用Gardner评分标准[7-8]进行评分，分别在第5～7天观察并对形成的囊胚进行评分。评分细则如下：根据囊胚腔的扩张程度分为6个时期，分别为1期(早期囊胚，囊胚腔体积<囊胚总体积的一半)、2期(囊胚腔体积>囊胚总体积的一半)、3期(完全扩张囊胚，囊胚腔体积占据整个囊胚)、4期(扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄)、5期(正在孵出囊胚，囊胚正从透明带裂口孵出)和6期(完全孵化囊胚，囊胚完全从透明带中孵出)。根据ICM和TE细胞数量多少及形态分为3个等级，分别为A级(ICM细胞数多且排列紧密；TE细胞数多，形成紧密的上皮)、B级(ICM细胞数少，松散；TE细胞数少，上皮松散)、C级(ICM细胞数很少或几乎没有，TE细胞很少或仅由几个稀疏细胞组成)。囊胚的扩张程度在3～6期，TE和ICM评分均在B级以上即定义为优质囊胚；囊胚评分在3BC/3CB及以上即可冷冻或移植。

卵裂期胚胎和囊胚均采用玻璃化冷冻技术进行冷冻，具体操作参照玻璃化冷冻试剂盒(Kitazato，日本)说明书进行。

3.FET：子宫内膜准备方案包括自然周期、人工周期和激素替代周期方案。移植当日内膜厚度达到7 mm方可移植。

移植当日解冻患者囊胚，解冻具体方法参照玻璃化解冻试剂盒(Kitazato，日本)说明书进行。解冻后的囊胚行激光辅助孵化后放入囊胚培养液(SAGE，美国)中置于37℃、5%CO2、5%O2培养箱中培养2 h，观察囊胚扩张情况。

4.主要观察指标和妊娠结局判定：本研究主要观察指标有移植后临床妊娠率、流产率、活产率等。具体定义如下：移植后14 d测血HCG，移植后28 d行超声检查可见孕囊及监测到胎心搏动者为临床妊娠。分娩妊娠≥28周的存活婴儿定义为活产；妊娠≥28周且<37周间分娩者即早产。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；活产率=活产分娩周期数/移植周期总数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；早产率=早产周期数/临床妊娠周期数×100%。

本研究还观察了新生儿出生结局方面的指标，主要有新生儿男女性别比、单胎分娩孕周、出生体重，及低出生体重(LBW)、极低出生体重(VLBW)、巨大儿(HBW)、极小于胎龄儿(VSGA)、小于胎龄儿(SGA)、大于胎龄儿(LGA)和极大于胎龄儿(VLGA)的发生情况。且为了排除多胎对新生儿出生体重、出生缺陷、是否早产以及是否剖宫产的影响，本研究仅对单胎分娩新生儿的出生结局指标进行分析。

三、统计学分析

结 果

一、单囊胚FET周期各组患者一般资料及促性腺激素(Gn)使用情况比较

本研究共纳入1 647个单囊胚FET周期，其中移植AA级单囊胚231个周期(A组)，移植AB/BA级单囊胚422个周期(B组)，移植BB级单囊胚885个周期(C组)，移植CB/BC级单囊胚109个周期(D组)。4组患者间平均年龄、体质量指数(BMI)、基础性激素水平、不孕年限、授精方式及Gn总量、Gn天数比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

二、单囊胚FET周期各组患者妊娠结局和新生儿出生结局比较

1.FET妊娠结局：各组患者的临床妊娠率、流产率及活产率组间比较均有显著性差异(P<0.01)，且随着ICM和TE评分的下降(从A组到D组)，临床妊娠率和活产率有逐渐下降的趋势，流产率则有逐渐上升的趋势。各组间的早产率比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

2.新生儿出生结局：截至2021年12月31日，A、B、C及D组活产的新生儿分别是113例、167例、357例和25例。新生儿出生性别比4组间有显著性差异(P<0.05)，A、B组出生的男婴比例有明显上升趋势，而D组出生女婴比例有明显上升趋势(表3)。各组分娩的新生儿出生孕周、出生体重(表3)及LBW、HBW、SGA、LGA等异常出生体重发生率比较均无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表1 各组患者的一般资料比较 [(-±s)，n(%)]

表2 各组患者妊娠结局比较(%)

表3 各组新生儿出生情况比较 [(-±s)，%]

表4 各组新生儿异常出生体重分类比较[n(%)]

三、影响囊胚发育潜能的其他相关因素在各组间的比较

根据囊胚的发育特点，对可能影响囊胚发育潜能的其他因素(包括D3胚胎评分、D3胚胎细胞数以及囊胚扩张程度、囊胚发育速度)进一步分析。各组间不同D3胚胎评分和D3胚胎细胞数的周期数占比存在显著性差异(P<0.01)。A组AA级囊胚中既往D3胚胎评分为Ⅰ级和Ⅱ级的优质胚胎占比达77.49%(179/231)，7～9细胞占比达76.62%；而在D组CB/BC级囊胚中既往D3胚胎评分为优质胚胎的比例显著下降，仅为45.87%(50/109)，7～9细胞数占比为60.55%(表5)。

各组间不同囊胚扩张程度和囊胚形成时间的周期数占比亦存在显著性差异(P<0.01)。各组间囊胚的扩张程度分布不均，但均以4期囊胚为主；囊胚的形成时间也不均衡，A组(AA级囊胚)在D5发育为囊胚的周期数占比高达93.94%，而D组(CB/BC级囊胚)较多于D6发育为囊胚，占比达74.31%(表5)。

表5 不同D3胚胎评分、胚胎细胞数及囊胚扩张程度、形成时间在各组间的分布情况[n(%)]

四、对单囊胚FET周期临床妊娠率和活产率的多因素Logistic回归分析

对临床妊娠率的影响因素进行多因素Logistic回归分析发现，女方年龄、BMI、不孕年限、D3胚胎细胞数、D3胚胎评分、囊胚扩张程度、囊胚形成时间对临床妊娠率的影响无统计学意义(P>0.05)。而随着囊胚ICM和TE评级的增高，临床妊娠率越高，且其影响具有统计学意义(P=0.000)(表6)。

对活产率的影响因素进行多因素Logistic回归分析发现，BMI、不孕年限、D3胚胎细胞数、D3胚胎评分、囊胚扩张程度、囊胚形成时间对活产率的影响无统计学意义(P>0.05)。而女方年龄、囊胚ICM和TE评级对活产率的影响具有统计学意义(P<0.05)(表6)。

表6 临床妊娠率和活产率的多因素回归分析

讨 论

如何筛选具有较高发育潜能的囊胚是单囊胚移植中非常重要的问题。本研究纳入1 647个单囊胚FET周期进行分析，结果表明囊胚的ICM和TE评级对判断囊胚的发育潜能具有一定价值，这与之前较多的文献报道类似。目前Gardner囊胚的评分标准[7-8]和人类IVF-ET实验室操作专家共识[15]均将ICM和TE评级作为评估囊胚质量的重要指标之一。Guo等[16]研究发现囊胚的ICM和TE评级为活产率的独立影响因素。Shi等[17]的研究结果表明囊胚的ICM质量是整倍体囊胚发生流产的潜在因素，A级ICM的囊胚移植后流产率显著低于B级。因此本研究以囊胚的ICM和TE评级这两个指标进行分组，分析发现随着囊胚ICM和TE评级的逐渐下降，囊胚移植后的临床妊娠率和活产率亦逐渐下降，流产率则逐渐上升。本研究结果显示，ICM和TE评级均为A的囊胚移植后(A组)的临床妊娠率为66.67%、活产率为48.92%，数据在4组中最高；流产率11.69%，为4组中最低。而ICM和TE评级为CB/BC的囊胚移植后(D组)的临床妊娠率37.61%、活产率22.94%，显著低于其他组；流产率34.15%，显著高于其他组(P均<0.05)。提示囊胚的ICM和TE综合评级可作为预测囊胚发育潜能的重要指标之一。

关于囊胚的发育速度是否会影响移植后的临床结局仍存在争议。Ferreux等[11]研究发现D6囊胚移植组与D5囊胚移植组相比活产率显著下降(29.6% vs. 17.0%，P<0.01)，D6优质囊胚形成率亦显著低于D5优质囊胚形成率(82% vs. 68%，P<0.001)，提示D6囊胚组的活产率下降可能是由于优质囊胚率下降导致的。而陈丽娜等[9]对938个优质单囊胚FET周期的数据进行分析发现，D5单囊胚移植组与D6单囊胚移植组有相似的活产率。本研究中以囊胚形成时间作为囊胚发育速度的指标，Logistic多因素分析的结果显示，囊胚的发育速度不是临床妊娠率和活产率的独立影响因素(P>0.05)。因此我们认为只要是优质囊胚移植，囊胚自身的发育速度并不明显影响囊胚种植后的妊娠结局。

本研究中，不同D3胚胎评分和细胞数在各组间的分布是不一致的，A组的AA级囊胚主要来源于Ⅰ级和Ⅱ级胚胎(占比达77.49%)，而D组CB/BC级囊胚来源于Ⅰ级和Ⅱ级胚胎的比例显著下降，仅为45.87%；形成的可移植囊胚中来源于4～6细胞D3胚胎的比例从A组的3.46%上升至D组的30.28%；且D3胚胎中发育速度较慢的胚胎在D组的分布相对较多(6.42%)。提示低评分囊胚多来源于D3评分较低且发育速度较慢的胚胎。Li等[18]研究发现，随着D3胚胎评级的下降，囊胚形成率也显著下降(P<0.01)，尤其是Ⅲ级胚胎与Ⅰ级胚胎之间，下降趋势有显著性差异(P<0.01)。Herbemont等[19]研究发现，D3/D2胚胎的评级对优质囊胚的种植潜能没有明显影响；我们的研究结果与之类似，本研究中多因素Logistic回归分析结果表明D3胚胎评分和细胞数不是临床妊娠率和活产率的独立影响因素，提示只要有囊胚形成，D3胚胎的评分和细胞数的多少并不明显影响该囊胚的种植潜能。

本研究还观察了不同ICM和TE评级的囊胚移植后新生儿出生结局情况，4组间早产率、新生儿出生孕周、出生体重和LBW等发生率比较均无显著性差异(P>0.05)。提示不论是优质囊胚还是非优质CB/BC级囊胚，虽然临床妊娠率和活产率有显著性差异，但是一旦获得活产，新生儿出生情况差异并不明显；但尚不能排除由于样本量较少而造成的结论偏倚。本研究结果与何于夏等[20]的研究类似。然而，本研究中4组间的出生婴儿性别比有显著性差异(P<0.05)，提示囊胚ICM和TE评级可能与出生性别比有一定关联。Maalouf等[21]也有类似的发现，他们分析了英国10年间经ART治疗出生的106 066个新生儿，其数据显示单囊胚移植后分娩的新生儿出生性别比显著上升(P<0.05)。

综上所述，在单囊胚FET周期中，囊胚的ICM和TE评分较为关键，是临床妊娠率和活产率的独立影响因素；其可作为移植后预测妊娠结局的一个重要参数，为临床上单囊胚移植策略的制定提供一定参考。