油相结构化对大豆蛋白藻油纳米乳液氧化稳定性的影响

杨韵仪，曹沐曦，陈文荣，万芝力,*，方素琼,*，杨晓泉

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，食物蛋白与胶体研究中心，广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东 广州 510641；2.仙乐健康科技股份有限公司，广东 汕头 515041）

提取自海洋藻类的藻油中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量高、安全可持续，然而藻油不溶于水，且DHA极易氧化变质产生酸、醛、酮等氧化物，影响风味、口感的同时也带来健康风险[1-2]。目前，食品工业常将其密封于软胶囊中以隔绝外界的氧化因子，但是存在食用不便、应用形式单一等缺陷，无法满足人们对多样化藻油产品日益增长的需求。研究团队已成功利用小分子甜菊糖（stevioside，STE）改善大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）的乳化特性，构建出高稳态的纳米乳液体系[3-5]。此外，SPI-STE复合体系已被证明能作为优良载体用于包埋多种天然活性成分[3,5-6]，可用于开发藻油纳米乳液，满足婴幼儿、老人等特殊人群的日常补充需求的同时，对拓展藻油在运动营养、特医食品等新兴领域中的应用具有重要意义。

然而，O/W纳米乳液含有丰富的水相以及比表面积极大的油水界面，会导致脂质快速氧化，这将严重限制该技术在藻油开发中的应用[7-8]。传统的抗氧化剂技术无法稳定高度不稳定的脂质（胡萝卜素、不饱和脂肪酸等），目前正在开发新技术以改变乳液的物理性质，从而抑制脂质氧化反应，如填充型水凝胶和油相结构化乳液[9-11]。其中，油相结构化策略通过将脂质捕获在凝胶网络中，从而降低其与水相氧化因子的接触，有效提高乳液的抗氧化性[7-9]。蜂蜡是一种常用的天然蜡，具有安全无毒、凝胶性优异、可塑性强、稳定性高等优良特性，已被美国食品药品监督管理局的食品添加剂标准允许使用，且没有进行添加量的限制[12]。近年来，蜂蜡作为脂质结构化助剂已被成功用于制备各种尺度的乳液[13-14]，在脂质抗氧化方面的研究仍停留在微米尺度。Wei Feilong等[15]比较了蜂蜡和单甘脂作为油相结构剂对乳液氧化的影响，结果表明蜂蜡能形成更致密的油凝胶网络，从而赋予乳液更好的氧化稳定性，延缓氧化效果并随蜂蜡添加量的增加而增强，然而蜂蜡结构化策略能否在纳米乳液中展现出优异的抗氧化效果还有待考究。

为探究蜂蜡结构化对藻油纳米乳液稳定性的影响，本研究首先研究蜂蜡对藻油的结构化行为，然后以SPI-STE复合体系作为乳化剂制备藻油纳米乳液，评估蜂蜡结构化对藻油纳米乳液形成及物化稳定性的影响，并尝试通过调控油相结构化构建高稳定性的藻油纳米乳液体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藻油（DHA含量≥40%） 内蒙古金达威药业有限公司；蜂蜡（酸值17.5 mg/g，皂化值89.1 mg/g，碘值9.3 mg/g，均以KOH计算） 北京丽康伟业科技有限公司；低温脱脂豆粕 山东禹王实业有限公司；STE（纯度＞90%） 山东海根生物技术有限公司；实验用其他化学试剂均为国产分析纯；实验用水为Million-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

Axioskop 40 Pol偏振光显微镜 德国Zeiss公司；U-HGLGPS多功能光学显微镜 日本Olympus公司；RS600HAKKE流变仪 美国赛默飞世尔科技公司；TGA/DSC1差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC） 瑞士梅特勒-托利多公司；T25 digital ULTRA TURRAX高速剪切机 德国IKA公司；M-110-EH-30高压微射流纳米均质机 美国MFIC公司；DELTA冷冻干燥机 德国Christ公司；Multimode SPMBX51原子力显微镜 美国维易科精密仪器有限公司；Nano-ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；7890B气相色谱仪 美国安捷伦科技公司；NanoPhotometer C40 Touch紫外分光光度计德国Implen公司；EC-TL01B紫外灯 广东省佛山益辰电子科技有限公司；TANKPE060纯水机 法国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 藻油凝胶的制备

取不同质量的蜂蜡至藻油中，于80 ℃水浴锅中搅拌加热 3 min后蜂蜡完全溶解，自然冷却至室温，放置24 h，得到含不同质量分数（0%、2%、3%、4%、6%、8%）蜂蜡的藻油凝胶。

1.3.2 藻油纳米乳液及油粉的制备

以SPI-STE复合体系为乳化剂制备藻油纳米乳液[5]。参考万芝力[3]的碱溶酸沉方法制备SPI，经杜马斯燃烧定氮法测得SPI冻干粉蛋白含量为（97.18±0.56）%。将SPI分散于10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌2 h后置于4 ℃水化过夜。取一定量的STE粉末至10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，搅拌至澄清。使用NaOH或HCl溶液调节SPI和STE溶液至pH 7.0，随后将两者混合并搅拌30 min，获得SPI-STE复合体系。

将藻油凝胶80 ℃水浴加热3 min，按油相与水相质量比1∶9加入处于相同温度（80 ℃）的SPI-STE复合体系中，搅拌获得油水混合液。将混合液先进行高速剪切机预均质（5000 r/min，2 min），随后立即进行高压均质处理（50 MPa，2 次），制得纳米乳液。乳液制备过程中样品温度始终保持在80 ℃。最终乳液中含有质量分数为10%的油相、1% SPI和0.5% STE。向乳液中加入0.04%叠氮钠防止染菌。

油粉由新鲜乳液冷冻干燥得到。

1.3.3 藻油凝胶微观结构观察

利用放大倍数为1000 倍的明场和偏光显微镜观察藻油凝胶的微观结构。将样品80 ℃水浴加热3 min，趁热将5 μL融化样品滴在预热的载玻片上，并用预热的盖玻片轻轻覆盖，室温下静置24 h后观察样品。

1.3.4 藻油凝胶热力学性质测定

采用DSC测量藻油凝胶融化和结晶的相变行为。取适量样品放入坩埚，以空坩埚作为对照。加热样品，2 ℃/min速率从20 ℃加热到85 ℃，保温10 min，以相同速率冷却至初始温度。

1.3.5 藻油凝胶流变学性质测定[16]

振荡测试：分别在应力0.1～1000 Pa、频率1 Hz和频率0.1～50 Hz、应力1 Pa条件下进行应力扫描和频率扫描，测定藻油凝胶样品的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。

流动测试：在剪切速率0.01～100 s-1条件下记录样品表观黏度的变化。选用直径35 mm平板，间隙1 mm，测试温度25 ℃。

1.3.6 藻油包封率测定[17]

取0.5 mL乳液至离心管中，称量乳液（m1）与离心管质量（m2）。加入1 mL己烷，5000 r/min离心10 min分离乳液与己烷。用针管将下层乳液全部吸出，加入离心管，用己烷润洗针管，加入离心管。将离心管敞口放置在通风橱内使己烷完全挥发，称量离心管终质量（m3）。按下式计算藻油包封率：

1.3.7 乳液粒度和Zeta电位测定

将乳液用pH 7.010 mmol/L磷酸缓冲液适当稀释后，用Nano-ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪测定乳液的平均粒径、多分散性指数（polydispersity index，PDI）和Zeta电位。参数设置：分散相（藻油）折射率1.503，吸收率0.002；连续相折射率1.333；测试温度25 ℃。

1.3.8 乳液贮存稳定性测定

将乳液于25 ℃贮存30 d后，按1.3.7节步骤测定乳液的粒度变化。

1.3.9 脂质氧化稳定性测定

热促氧化条件：将新鲜乳液放入40 ℃恒温箱中贮存30 d；光促氧化条件：用紫外灯照射新鲜乳液8 h，紫外线波长为254 nm，光辐照度为6.9 mW/cm2。根据杜振亚[18]的方法分别在热促氧化和光促氧化条件下测定乳液脂质氧化产物含量。

1.3.9.1 一级氧化产物脂质氢过氧化物含量测定

取200 μL乳液，加入1.5 mL异辛烷-异丙醇溶液（3∶1，V/V），涡旋振荡3 次，每次持续10 s，5000 r/min离心5 min。取200 μL上清液，加入2.8 mL甲醇-正丁醇溶液（2∶1，V/V），依次加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸铵溶液和15 μL二价铁离子溶液（等体积混合0.132 mol/L氯化钡和0.144 mol/L硫酸亚铁），混匀，密封静置20 min后于510 nm波长处测定吸光度。使用30%过氧化氢溶液制备系列标准溶液（50、100、200、300、400、500 μmol/L）绘制标准曲线。

1.3.9.2 二级氧化产物含量测定

采用硫代巴比妥酸法测定二级氧化产物丙二醛的含量。取200 μL乳液，加入1.8 mL去离子水，混匀，加入4 mL硫代巴比妥酸试剂，漩涡振荡3 次，每次持续10 s，随后沸水浴15 min。冷却至室温后6000 r/min离心20 min，取上清液，于535 nm波长处测定吸光度。使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷制备系列标准溶液（2、5、10、20、30、40 μmol/L）绘制标准曲线。

采用动态顶空法检测挥发性二级氧化物己醛的含量。取10 mL新鲜乳液于顶空瓶中，40 ℃避光静置30 d后使用气相色谱仪测定己醛含量。色谱条件：HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：以4 ℃/min从40 ℃上升到50 ℃，随后立即以5 ℃/min上升到100 ℃，再以8 ℃/min上升到230 ℃；进样口和火焰离子化检测器温度均为250 ℃。载气为氮气，流速1.0 mL/min，分流比1∶1。

1.4 数据处理

利用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行多组样品间差异显著性分析，采用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 藻油凝胶的理化性质研究

2.1.1 藻油凝胶的外观及微观结构

油凝胶的临界凝胶浓度与其凝胶能力相关[19-22]。图1A中样品外观显示，将藻油凝胶倒置后，含2%蜂蜡的藻油凝胶在宏观上不能凝固，含3%蜂蜡的藻油凝胶呈半凝固状态，而含4%～8%蜂蜡的藻油凝胶能形成稳定的凝胶。进一步通过显微镜观察其晶体微观形貌（图1B、C），纯蜂蜡的网络结构致密，晶体较为细腻且分布均匀。从含2%和3%蜂蜡的藻油凝胶中可观察到晶体呈团簇花瓣状均匀地分散于凝胶体系中，晶体形貌、结构清晰可见，直径约为15 μm，与Ashok等[19]观察到的蜂蜡凝胶簇群结构相似。此外，视野中含3%蜂蜡的藻油凝胶的晶体数量比2%更多，但是单个晶体的堆积不能使含3%蜂蜡的藻油凝胶维持稳定的凝胶状态。当蜂蜡质量分数达到4%时，蜂蜡晶体较多从而发生聚集并进一步互连，形成3D网络结构，单个晶体微粒几乎不可见，与纯蜂蜡的微观结构相似，表明藻油已完全凝胶化[22]。随着蜂蜡质量分数进一步增加（6%～8%），晶体网络更致密，与Winkler-Moser等[23]的报道一致。

图1 含不同质量分数蜂蜡的藻油凝胶及纯蜂蜡的倒置外观图（A）、明场显微镜图（B）和偏振光显微镜图（C）Fig.1 Visual appearance (A),bright (B) and polarized light microscopic (C) images of algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

2.1.2 藻油凝胶的DSC分析

由图2可知，纯蜂蜡在加热过程中，于66.5 ℃处出现一个强吸热峰，即熔融温度[23-25]；在冷却过程中，存在两个放热峰（峰1为50.2 ℃，峰2为55.6 ℃），即蜂蜡在峰2时开始结晶，在峰1处发生晶型转变（β型变为α型）[23,25-26]。而藻油在20～85 ℃的温度变化范围内无明显的结晶峰和熔融峰。藻油凝胶在加热过程中，蜂蜡质量分数2%的藻油凝胶在45.7 ℃出现吸热峰，但峰面积较小；随着蜂蜡含量逐渐增大，藻油凝胶的吸热峰逐渐后移且峰面积增大，呈现向纯蜂蜡样品靠拢的趋势；当蜂蜡质量分数增至8%时，吸热峰为54.1 ℃，轮廓明显。而在冷却时，含2%蜂蜡的藻油凝胶在34.5 ℃处出现结晶峰（峰2），晶型转变峰（峰1）不明显；随着蜂蜡含量逐渐增大，峰1逐渐可观测到，两个放热峰呈现位置后移、面积增大的趋势；蜂蜡质量分数8%的藻油凝胶中，放热峰出现在35.2 ℃和46.7 ℃处。上述结果表明，藻油凝胶的熔融温度低于60 ℃，结晶温度高于30 ℃，可适应大多数食品的加工和贮存条件，符合工业化生产的要求[27]。

图2 蜂蜡、藻油及含不同质量分数蜂蜡的藻油凝胶的加热（A）和冷却（B）曲线Fig.2 Comparative heating (A) and cooling (B) curves of pure beeswax,algae oil and algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

2.1.3 藻油凝胶的流变学特性

藻油凝胶的微观结构与其机械性质密切相关，通过测定样品的流变学特性进一步了解藻油凝胶的结构性质。由图3A可知，在线性黏弹区内，所有样品的G’均显著高于G”，说明所有样品均表现出类弹性固体性质[18,28]。随着蜂蜡质量分数增加，藻油凝胶的G’和G”、屈服应力值及线性黏弹区均增大，说明油凝胶具有更强的机械性能和抵抗外力破坏的能力[16,19,28-29]。如图3B所示，2%蜂蜡质量分数的藻油凝胶在0.1～50 Hz范围内表现出较强的频率依赖性，这是因为此时样品的黏弹性较弱，容易受到频率的扰动而导致结构被破坏；3%～8%蜂蜡质量分数的藻油凝胶表现出较低的频率依赖性，表明样品的振荡性质受所施加应力的影响较小，显示出较好的黏弹性[28-29]。

图3 含不同质量分数蜂蜡的藻油凝胶的应力扫描（A）、频率扫描（B）及黏度曲线（C）Fig.3 G’ and G” versus stress (A),G’ and G” versus frequency (B)and viscosity versus shear rate curves (C) of algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

藻油凝胶黏度反映样品的流动特性[27-28]。由图3C可知，所有藻油凝胶均表现出强烈的剪切变稀行为，且样品的表观黏度随着蜂蜡质量分数的增加而提高，表明形成了强度更大的凝胶结构[28-29]，与黏弹性测试结果一致。

2.2 藻油纳米乳液的性质分析

如表1 所示，油相中不含蜂蜡时，藻油纳米乳液的平均粒径为178.40 nm，PDI值为0.15，Zeta电位为-29.25 mV，与课题组前期研究结果[5-6]一致。以蜂蜡结构化的藻油凝胶为油相，得到的藻油纳米乳液平均粒径为184.18～204.03 nm，PDI值均小于0.30，Zeta电位处于-29～-27 mV间，表明蜂蜡的添加对藻油纳米乳液（约200 nm）的形成无明显影响。相较于对照样品，蜂蜡的添加增大了乳液的平均粒径；当蜂蜡添加量为2%～4%时，乳液的平均粒径随蜂蜡质量分数的增加而增大；当蜂蜡质量分数进一步增加时（6%～8%），乳液的平均粒径变化不显著，但值得注意的是，蜂蜡质量分数8%的样品PDI值达到0.27，说明该乳液中存在不均一的聚集体[3]。这可能是由于此时较高的蜂蜡添加量构筑出刚性较强的凝胶网络，乳液自然冷却过程中，晶体的生长速率过快以及局部不平衡性（一旦胶凝剂在特定位置形成晶核便会继续生长）导致界面被刺破，从而引起乳液液滴局部失稳并黏结[9,15]。藻油包封率结果显示，蜂蜡的添加对藻油包封率有轻微改善作用，但改善幅度较小（2.23%～4.22%）。

表1 藻油纳米乳液的平均粒径、PDI值、Zeta电位及藻油包封率Table 1 Mean particle diameter,PDI,zeta-potential and encapsulation efficiency of algal oil-based nanoemulsions

2.3 藻油纳米乳液及油粉的贮存稳定性

如图4A所示，藻油纳米乳液在25 ℃贮存30 d，所有样品仍呈现正常的乳白色，质地均匀，无明显的乳析或相分离现象，样品间无明显的外观差异。如图4B所示，贮存期内所有样品的粒径变化均小于60 nm，表明乳液均具有良好的长期稳定性[7,19]。其中，对照样品和8%样品的平均粒径变化最大（分别增大52 nm和51 nm），表明适量的蜂蜡添加量（2%～6%）利于乳液的长期稳定。

如图4C所示，未油相结构化（0%）和含2%蜂蜡的油粉均呈淡黄色，有轻微的油析现象，这可能是因为快速的溶剂蒸发对界面膜的强扰动破坏[30-31]；贮存30 d后，黄色加深，表明油析程度加重。含3%～6%蜂蜡的样品呈乳白色，无明显的油析现象；贮存30 d后，颜色、状态均无明显变化，说明藻油凝胶机械强度的增强赋予了乳液更稳定的热力学性质，即使经历了相对苛刻的冻干过程，其界面结构仍保持相对完整[31-32]。而含8%蜂蜡的样品呈乳白色，贮存30 d后变为深黄色，出现严重的油析现象，表明该样品贮存稳定性较差，可能是此时结构化的油相刚性较强，影响了界面层的稳定性，与粒径测定结果一致。由于藻油被凝胶网络捕获，新鲜状态下油脂没有明显的溢漏，但随着时间的推移，未被完全包封的油脂快速氧化，导致粉末变色、凝结。这些结果表明添加3%～6%蜂蜡能明显增强藻油纳米乳液和油粉的物理稳定性。

图4 含不同质量分数的藻油纳米乳液外观（A）、平均粒径（B）及其油粉外观（C）Fig.4 Appearance (A),mean particle diameter (B) of algae oil-based nanoemulsions containing different amounts of beeswax,and appearance of powders prepared from each of them (C)

2.4 藻油纳米乳液的氧化稳定性

2.4.1 热促氧化

油脂氧化为链式反应，初级反应产物氢过氧化物可用于评估乳液氧化的起始速率[3,31]。如图5A所示，热促氧化过程中，贮存第18天时，所有藻油纳米乳液的脂质氢过氧化物含量均达到峰值，对照组的氢过氧化物含量（44.63 mmol/（L·kg））远高于其他样品。随着蜂蜡添加量的增大（2%～6%），样品的氢过氧化物含量逐渐降低至22.23 mmol/（L·kg）；当蜂蜡质量分数为8%时，样品的氢过氧化物含量略微增大（23.41 mmol/（L·kg））。氧化稳定性的提升可能是因为蜂蜡对油相的固化，抑制促氧化金属离子以及自由基对多不饱和脂肪酸不饱和键的攻击[2,9]。因此，随着蜂蜡含量的增加，油相凝胶网络增强，物理屏蔽作用的提高有效提升乳液的氧化稳定性；但是蜂蜡含量过高时，乳液中存在部分絮凝体影响了乳液的氧化稳定性。图5B为乳液经30 d贮存后产生的挥发性物质的顶空分析结果，其中己醛是藻油中主要的次级氧化产物之一[3,31,33]。结果显示，对照样品的己醛峰面积最大，其次为含2%、3%、4%、8%、6%蜂蜡样品，与初级氧化物的变化趋势一致。热促氧化的综合数据表明，藻油中添加6%蜂蜡对乳液的氧化稳定性改善效果最显著。

图5 藻油纳米乳液在热促氧化下脂质氢过氧化物的含量变化（A）和己醛含量分析（B）Fig.5 Changes in lipid hydroperoxides (A) and hexanal (B) contents of algal oil-based nanoemulsions under thermal treatment

2.4.2 光促氧化

如图6A所示，对照样品和含2%蜂蜡藻油纳米乳液的初始氧化速率较快，在2 h左右氢过氧化物含量已达到峰值；含3%、4%和8%蜂蜡藻油纳米乳液在4 h左右出现峰值；含6%蜂蜡藻油纳米乳液的初级氧化速率最慢，在6 h左右出现峰值。由图6B可知，曝光8 h后，含0%、2%、3%、4%、8%、6%蜂蜡的样品中的次级氧化物丙二醛含量依次减小，与对照样品相比氧化值分别降低了17.67%、28.74%、36.13%、37.23%、77.48%，表明油相中添加蜂蜡能显著延缓乳液的光促氧化进程[3,31,33]，其中6%蜂蜡添加量效果最佳。光促氧化的研究结果与热促氧化相符。

图6 藻油纳米乳液在光促氧化下脂质氢过氧化物的含量变化（A）和丙二醛含量分析（B）Fig.6 Changes in lipid hydroperoxides (A) and malondialdehyde (B)contents of algal oil-based nanoemulsion upon light exposure

3 结论

以蜂蜡为天然油相凝胶剂、SPI-STE复合体系为天然乳化剂，构建出具有高贮存稳定性与氧化稳定性的藻油纳米乳液载体，实现对藻油的保护，拓展其在食品加工中的应用。结果表明，蜂蜡添加量达到4%时，大量晶体联结成稳固的网络结构，从而构筑出稳定的油凝胶。蜂蜡对藻油的结构化对纳米乳液（约200 nm）的形成没有明显影响，所有样品的平均粒径、Zeta电位及藻油包封率相近。乳液稳定性结果表明，蜂蜡的固化作用使乳液具有更好的贮存稳定性，但是凝胶强度过大（8%蜂蜡添加量）会影响界面稳定性，导致乳液物理稳定性变差。乳液的热促氧化和光促氧化研究表明，油相中添加蜂蜡的样品均表现出明显提升的氧化稳定性；其中，蜂蜡添加量为6%时延缓藻油乳液氧化的效果最明显。本研究结果表明，经蜂蜡油相结构化的大豆蛋白基纳米乳液体系可作为藻油的高稳态载体应用于食品工业。