腹部推拿对溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症及脊髓背角AKT蛋白表达的影响

方佳钰，黄红叶，王晓华，陈水金，江煜，陈乐春，张幻真，陈进城，林志刚

1.福建中医药大学，福建 福州 350100；2.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；3.福建省康复技术重点实验室，福建 福州350003

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，是引起腹痛、腹泻的临床常见病之一，属现代难治性疾病[1-2]。腹部推拿治疗UC效果显著，能改善腹泻、便血、腹痛等症状，具有安全、无不良反应等优势[3-5]，但其作用机制尚不明确。研究表明，脊髓背角蛋白激酶B（AKT）能通过磷酸化调控UC发生发展[6]。本实验通过观察腹部推拿对UC 模型大鼠肠道炎症及脊髓背角AKT、p-AKT表达的影响，探讨腹部推拿治疗UC的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量150～160 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学动物实验中心，温度20～26 ℃，相对湿度45%，12 h明暗交替，自由摄食饮水。实验过程严格遵守动物伦理原则，并经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2021046）。

1.2 主要试剂与仪器

AKT抗体、p-AKT抗体、HRP标记山羊抗兔IgG（南京Bioworld公司，货号分别为BS1810、BS4007、BS13278），美沙拉嗪片（佳木斯鹿灵制药有限公司，批号210907），HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号G1120）。自制大鼠腹部推拿固定器（专利号ZL201821139321.X），AVANTI J-15R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司），Tetra型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），Gene Pulser Xcell型电转仪（美国Bio-Rad公司），Gel Doc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），Gel Doc EZ型成像及分析软件（美国Bio-Rad公司）。

1.3 分组及造模

大鼠单笼适应性饲养7 d，按随机数字表法分为正常组、模型组、推拿组和美沙拉嗪组，正常组11只，其余每组13只。参照Poulsen[7]方法，采用5%葡聚糖硫酸钠溶液（避光配制）自由饮用7 d诱导UC大鼠模型，正常组饮用蒸馏水。

1.4 干预

推拿组造模第2日开始进行腹部推拿干预，干预前将大鼠置于自制腹部推拿固定器10 min适应环境。操作者左手置于腹部推拿固定器尾端，防止大鼠向后退离，右手食指进行摩腹手法操作（见图1），将食指指腹置于“关元”，按“关元-带脉（右）-鸠尾-带脉（左）”顺序[8-9]做逆时针节律性推拿，频率120次/min，每次10 min，每日1次，共15次。推拿结束后大鼠单独静置1 min。美沙拉嗪组造模第2日起予0.035 g/mL美沙拉嗪药液灌胃，给药体积2 mL/100 g，连续15 d。正常组和模型组大鼠俯卧位束缚于固定器中10 min，不予腹部推拿治疗。

图1 大鼠腹部推拿演示

1.5 一般状况观察

每日观察大鼠精神状态、毛发色泽、粪便改变情况等。

1.6 疾病活动指数评分

第1、3、6、9、11、14、16日，参照文献[10]进行疾病活动指数（DAI）评分，包括体质量减轻程度、粪便性状、粪便隐血情况。DAI评分=（体质量下降评分+粪便性状评分+粪便隐血评分）÷3。评分标准见表1。

表1 DAI评分标准

1.7 HE染色

实验结束后，大鼠腹腔注射1.25 g/kg乌拉坦麻醉后，颈椎脱臼处死，取距肛门5～8 cm处结肠组织，生理盐水冲洗，置于10%中性福尔马林溶液中固定，经脱水、石蜡包埋、切片（厚度4 μm）后，常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察结肠组织病理变化。

1.8 Western blot检测

取脊髓背角，加入裂解液（组织∶裂解液=1∶12.5），冰上裂解30 min，超声匀浆，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。经10%SDS-PAGE后，将蛋白转至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶常温封闭1 h，分别加入AKT一抗（1∶500）、p-AKT 一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜，加入HRP标记二抗，常温孵育1 h，采用ECL发光试剂显影，凝胶成像系统成像，用Image Lab软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 腹部推拿对模型大鼠一般情况的影响

实验过程中，模型组大鼠因服用葡聚糖硫酸钠溶液造模致长期严重腹泻死亡2只，美沙拉嗪组大鼠死亡2只，可能是美沙拉嗪的不良反应导致，空白组和推拿组均无死亡。

正常组大鼠活泼喜动，皮毛顺滑光亮，形体匀称丰盈，大便为深褐色颗粒状，无便隐血，肛周清洁，体质量稳步增加，状态良好；模型组大鼠倦怠少动，皮毛黯淡干枯，形体瘦削，缩背扎堆，粪便稀溏，可见脓血，肛周污秽黏腻，体质量缓慢增长甚至下降，状态萎靡；推拿组大鼠整体状态逐渐向好，皮毛光泽恢复，无脓血便，肛周较清洁，活跃多动；美沙拉嗪组大鼠状态逐渐恢复，皮毛光泽度有所改善，但毛发颜色整体发黄。见图2。

图2 各组大鼠一般情况示例

2.2 腹部推拿对模型大鼠疾病活动指数评分的影响

与正常组比较，模型组大鼠第3日起DAI评分明显升高（P<0.05）；与模型组比较，推拿组和美沙拉嗪组大鼠第9日起DAI评分明显降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠DAI评分比较（，分）

表2 各组大鼠DAI评分比较（，分）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3 腹部推拿对模型大鼠结肠组织病理形态的影响

正常组大鼠结肠黏膜上皮细胞完整、排列整齐，杯状细胞丰富，无充血、水肿，腺体结构完整，无溃疡形成，无炎性细胞浸润；模型组大鼠结肠上皮细胞破损、排列紊乱，黏膜充血、水肿，腺体破坏，杯状细胞明显减少，伴大量炎性细胞浸润，部分区域有溃疡形成，部分出现增厚黏连，肠管变形；推拿组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织病变有不同程度改善，黏膜上皮损伤有所修复，充血、水肿明显减轻，腺体、杯状细胞增多，排列较整齐，炎性细胞浸润明显减少。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织形态（HE染色，×100）

2.4 腹部推拿对模型大鼠脊髓背角蛋白激酶B 表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，推拿组和美沙拉嗪组大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表达明显降低（P<0.05）。各组大鼠AKT蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图4、图5。

图4 各组大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白免疫印迹

图5 各组大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白表达比较（，每组6只）

3 讨论

UC 属中医学“肠澼”“泄泻”“痢疾”等范畴。《素问·太阴阳明论篇》有“食饮不节，起居不时者，阴受之……阴受之则入五藏……入五藏则䐜满闭塞，下为飧泄，久为肠澼”，指出UC的主要病因是饮食没有节制，作息不规律。中医认为，中焦为人体气机枢纽，是后天之本。中焦气机通畅，升清降浊，则上下脏腑得以沟通，人体得以康健，正气存内，邪不可干[11]。本实验采用腹部推拿手法主要为水平方向的腹部摩法，《摩腹运气图考》记载：“摩腹之法，能通和上下，分理阴阳，去旧生新，补不足，泻有余。”可见摩腹具有清肠温中补虚的作用，通过该手法的调理，能达到通腑泻浊的目的。目前，推拿已应用于UC的治疗，能有效改善患者腹泻、腹痛症状[3]。

本实验以大鼠为研究对象，以腹部推拿为干预手法。临床腹部推拿多以掌面为干预接触面，但因大鼠身体和肢爪较小，故本实验在干预时以食指指腹模拟临床，便于进行推拿手法的操作。

DAI评分结果显示，腹部推拿能有效改善UC模型大鼠腹泻、便血等症状，表明腹部推拿手法对模型大鼠已受损的肠道功能有一定恢复作用。且推拿组DAI评分与美沙拉嗪组无显著差异。在大鼠饲养和粪便采集过程中发现，美沙拉嗪组大鼠毛发发黄，进行便隐血试纸检测时试纸出现棕褐色黄染情况，可能是美沙拉嗪药物的不良反应所致。且在实验过程中推拿组大鼠无死亡情况，美沙拉嗪组大鼠有2只死亡，可见腹部推拿具有安全、无不良反应的优势。HE染色结果也显示，模型大鼠结肠上皮细胞破损，黏膜充血、水肿，有大量炎症细胞浸润及溃疡形成。推拿组大鼠结肠黏膜损伤明显减轻，炎性细胞浸润有所减少，说明腹部推拿治疗能改善大鼠结肠组织病理损伤。

当结肠受到炎症刺激时，脊髓内的兴奋性神经递质如脑源性神经营养因子、P物质等从初级传入神经元集中释放到脊髓背角，并与各自受体结合，促进信号转导，最终导致内脏高敏感[12]。AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，可通过催化自身丝氨酸473（Ser473）和苏氨酸（Thr308）位点的磷酸化而被激活，只有在这2个位点磷酸化后，AKT才能被充分激活[13]。研究发现，AKT活化与UC发生发展密切相关，电针能通过抑制AKT磷酸化缓解UC大鼠肠道症状[14]。进一步研究发现，结肠炎症发生后，脊髓背角AKT被激活，从而介导后续一系列级联反应，调控结肠炎的发生发展[6]。本研究结果显示，模型组大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表达明显升高，与上述研究结果[6]一致。经腹部推拿干预后，脊髓背角p-AKT蛋白表达明显降低，表明腹部推拿能抑制模型大鼠脊髓背角AKT磷酸化，从而减轻炎症级联反应。

综上，腹部推拿能改善UC模型大鼠腹泻、便血等肠道炎症症状，并可能通过抑制脊髓背角AKT磷酸化发挥抑制肠道炎症作用，其通过哪些途径调控AKT及具体作用靶点有待后续进一步研究。