基于高效液相色谱法测定紫云冰脆李果实的生理指标含量

罗昌国，袁启凤，陈守一，田晓慧，王天宇

(贵州省果树科学研究所，贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】紫云冰脆李是2020年获得国家农产品地理标志登记证书的地方品种，作为地方特色果树，其经济效益高，产业发展迅速，是紫云当地农村经济发展的支柱产业，深受种植者及消费者的喜爱。近年来，随着高效液相色谱技术的普及，其更多地被应用于食品、药品和环境等分析[1]。可溶性糖是果品营养品质的重要组成部分[2]，糖和酸的比例或转化则是影响水果风味的重要因子[3]；B族维生素属一种水溶性维生素，是推动体内代谢，将糖、脂肪和蛋白质等转换成能量不可缺少的物质，有利于人体健康，越来越受到学者关注[4]；有机酸是水果中酸的主要成分，其决定水果的风味浓或淡。因此，测定紫云冰脆李果实的糖、酸和B族维生素含量，有利于了解紫云冰脆李的营养成分和价值，有助于进一步分析其风味形成的主要原因。【前人研究进展】巫伟峰等[5-6]研究表明，皇冠李、黑琥珀李、葡萄李、西瓜李和蜂糖李以苹果酸为主，占总酸含量的89%、92%、86%、75%和88%；李鹏等[7]研究发现，黑珍珠李果皮的苹果酸和蔗糖含量最高；刘硕等[8]研究李属(Prunus)果树品种资源果实糖和酸的组分及其构成差异发现，李果实的可溶性糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇，除欧洲李外，其他种均以苹果酸为主，占总酸的63.24%～96.05%。【研究切入点】紫云冰脆李果肉黄绿色、内质酥脆、味甜，但其果实可溶性糖、有机酸和B族维生素含量的研究鲜见报道，不利于紫云冰脆李的开发利用。【拟解决的关键问题】以紫云冰脆李为试材，采用高效液相色谱测定其果实成熟期果皮和混合样品的可溶性糖、有机酸和B族维生素的组分和含量，分析紫云冰脆李所含糖、酸和B族维生素的种类，了解紫云冰脆李的营养价值，以期为紫云冰脆李的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 紫云冰脆李 成熟紫云冰脆李果实采自紫云县火花镇。

1.1.2 试剂 甘露醇、果糖、山梨醇、蔗糖和葡萄糖标准品，购自阿拉丁公司；麦芽糖标准品，购自美伦公司；草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、莽草酸和酒石酸标准品，购自Sigma公司；维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素B12标准品，购自Sigma公司；乙腈(色谱纯)、三氟乙酸(色谱纯)、冰乙酸(优级纯)、盐酸和氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；水符合GB/T 6682一级水的规定；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备 TU1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；台式高速离心机，德国SORVAL公司；AR5120电子天平，美国AHOΜS公司；Ultimate3000高效液相色谱仪，赛默飞公司；旋转混合器，海门市其林贝尔公司；便携式超声波清洗仪，深圳杰拓科技有限公司；Agilent1100高效液相色谱仪，美国安捷Agilent公司；Waters ACQUITY UPLC，沃特世科技有限公司。

1.2 方法

在果实成熟期选取5株生长势一致的健壮植株作为采样树，每株按左、右、上、中和下采摘成熟度一致、无病虫害的果实20个，重复3次。果肉与果核分离后，快速用液氮研麿并用锡箔纸包裹，于-70℃超低温保存备用。

1.2.1 可溶性糖组分的测定

1) 标准溶液配制。以水为溶剂，配制10 mg/mL的麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇标准品母液；分别配制浓度梯度为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL的标准液。

2) 液相条件。色谱柱：Waters.XBridgeTM.Amide(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)，柱温：50℃；流动相A(0.1%三乙胺乙腈)∶流动相B(0.1%三乙胺水)=80∶20；梯度：等度；CAD：雾化温度：High；数据采集频率：10 Hz；流动相流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

3) 检测方法。分别称取果皮、混合样品(除核外的带皮果肉)5.0 g匀浆后的试样，向样品粉末中加入50 mL超纯水，缓慢加入乙酸锌和亚铁氰化钾溶液各5 mL，加水定容至100 mL，超声提取30 min，过滤，弃去初滤液，过0.45 μm滤膜，采用高效液相色谱-CAD(电喷雾)测定提取样品可溶性糖的各组分含量。

1.2.2 有机酸组分的测定 参照《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》(GB 5009.157—2016)[9]进行。

1) 标准溶液配制。以0.01 mol/L磷酸二氢钾为溶剂，配制10 mg/mL的草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、莽草酸和酒石酸标准品母液；分别配制浓度梯度为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL的标准液(草酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸)；配制浓度梯度为0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的标准液(莽草酸)。

2) 液相条件。分析柱：BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：0.01 moI/ L磷酸二氢钾溶剂；紫外检测器：G4212-60008二极管阵列检测器；检测波长：210 nm；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL。

3) 检测方法。分别取果皮和混合样品5.0 g，定容至100 mL，取5～20 mL，冻干后用0.1～0.5 mL pH为1的盐酸溶液复溶，过0.45 μm滤膜，采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定有机酸各组分含量。6种有机酸均在12 min内被完全分离，且分离效果良好，依次为草酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸、柠檬酸和琥珀酸。

1.2.3 B族维生素的测定

1) 标准溶液配制。维生素B1标准贮备溶液：准确称取维生素B1标准品0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解，超声15 min，待全部溶解后用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，溶液浓度为200 μg/mL。避光操作，于2～8℃冰箱保存。维生素B2标准贮备溶液：准确称取维生素B2标准品 0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，加浓度为2 mol/L氢氧化钠溶液5 mL溶解，超声使其完全溶解，加入60 mL水和2.5 mL冰乙酸，用水定容至刻度，溶液浓度为200 μg/mL，于2～8℃冰箱保存。维生素B6标准贮备溶液：准确称取维生素B6标准品0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，超声15 min，待完全溶解后用水定容至刻度，溶液浓度为200 μg/mL，于2～8℃冰箱保存。维生素B12标准贮备溶液：准确称取维生素B12标准品0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，超声15 min，待完全溶解后用水定容至刻度，溶液浓度为200 μg/mL，于2～8℃冰箱保存。

2) 液相条件。色谱柱：C18，150 mm×4.6 mm，粒径 5 μm；柱温：30℃；流速：1.30 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

3) 检测方法。分别准确称取样品2.5 g，置于50 mL容量瓶中，加入盐酸溶液40 mL，80℃水浴超声提取30 min，中间振摇2～3次。用水定容，摇匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液适量过滤膜，在高效液相色谱反相柱上分离，在280 nm处测定，外标法定量。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2003和SPSS 20.0对试验数据进行统计分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 紫云冰脆李果实生理指标的色谱分析

2.1.1 可溶性糖 由图1可知，高效液相色谱方法可较好地分离紫云冰脆李果皮和混合样品的可溶性糖组分。标准样品中各组分出峰顺序为果糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖，其出峰时间分别为15.848 min、18.596 min、18.928 min、19.651 min、31.709 min(图1A)。果皮样品中5种糖的出峰时间分别为15.927 min、18.439 min、18.788 min、19.584 min、32.126 min；混合样品中未检测出山梨醇，果糖、甘露醇、葡萄糖和蔗糖的出峰时间分别为15.887 min、18.822 min、19.753 min、32.255 min(图1B)。

图1 紫云冰脆李果实可溶性糖的色谱分析Fig.1 Chromatographic analysis of soluble sugars in fruits of Ziyun Plum

2.1.2 有机酸 从图2看出，用高效液相色谱法能较好地分离紫云冰脆李果皮和混合样品的有机酸组分。标准样品中各组分的出峰顺序为草酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸、柠檬酸、琥珀酸，其出峰时间分别为2.984 min、3.364 min、4.334 min、4.621 min、7.498 min、9.821 min，所有样品均在12 min内出峰(图2A)；果皮样品6种有机酸的出峰时间分别

图2 紫云冰脆李果实有机酸的色谱分析Fig.2 Chromatographic analysis of organic acids in fruits of Ziyun Plum

为3.086 min、3.527 min、4.361 min、4.655 min、7.551 min、9.869 min(图2B)；混合样品6种有机酸的出峰时间分别为3.078 min、3.511 min、4.335 min、4.631 min、7.519 min、9.853 min(图2C)。对照标准样品色谱图得出，紫云冰脆李有机酸组分分别为草酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸、柠檬酸和琥珀酸，出峰时间和标准样品大致相同。

2.1.3 B族维生素 由图3可知，紫云冰脆李的4种B族维生素在270 nm处(B1、B2、B12)和395 nm处(B6)得到良好分离。标准样品的B族维生素出峰顺序为B6、B1、B2、B12，其出峰时间分别为3.512 min、3.954 min、13.029 min、13.201 min，所有样品均在17 min内出峰(图3A)；果皮样品的出峰时间分别为3.403 min、3.942 min、12.978 min、13.180 min(图3B)；混合样品的出峰时间分别为3.394 min、3.943 min、12.962 min、13.173 min(图3C)。

图3 紫云冰脆李果实B族维生素的色谱分析 Fig.3 Chromatographic analysis of B vitamins in fruits of Ziyun Plum

2.2 紫云冰脆李果实生理指标的含量

2.2.1 可溶性糖 从表1看出，紫云冰脆李果皮和混合样的总糖含量分别为66.48 mg/g和89.54 mg/g，主要组分分别为果糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖和麦芽糖；混合样的可溶性总糖含量显著高于果皮，其中，麦芽糖在果皮和混合样中均未检出，山梨醇在混合样中未检出。果皮的果糖和葡萄糖显著高于混合样，共占总糖的66.41%；甘露醇和蔗糖显著低于混合样，分别占果皮总糖的7.27%和18.14%。混合样以蔗糖含量最高，占总糖的37.31%；葡萄糖次之，占22.41%。综合看，果皮中能检测到较高含量的山梨醇，而混合样中未检出，说明紫云冰脆李果实的山梨醇主要存在于果皮；混合样中能检测到较高含量的甘露醇，说明甘露醇主要存在于果肉；果皮与合混合样中均未检测出麦芽糖。

表1 紫云冰脆李果实可溶性糖各组分含量 Table 1 Content and proportion of different soluble sugar components in fruits of Ziyun Plum

2.2.2 有机酸 由表2可知，紫云冰脆李果皮和混合样的总酸含量分别为10 777.54 μg/g和7 564.33 μg/g，果皮的总酸显著高于混合样。果皮和混合样的有机酸均以苹果酸为主，分别占果皮和混合样总酸的87.66%和87.38%，果皮中除琥珀酸与混合样差异不显著外，其余5种酸均显著高于混合样。果皮有机酸依次为苹果酸(9 447.22 μg/g)>草酸(441.09 μg/g)>酒石酸(322.77 μg/g)>柠檬酸(317.66 μg/g)>琥珀酸(228.91 μg/g)>莽草酸(19.89 μg/g)；混合样依次为苹果酸(6 610.07 μg/g)>草酸(275.91 μg/g)>柠檬酸(247.60 μg/g)>琥珀酸(223.76 μg/g)>酒石酸(196.97 μg/g)>莽草酸(10.01 μg/g)。综合看，紫云冰脆李果皮和混合样均含有苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和莽草酸，以苹果酸含量最高，莽草酸含量最低。

表2 紫云冰脆李果实有机酸各组分含量Table 2 Content and proportion of different organic acid components in fruits of Ziyun Plum

2.2.3 B族维生素 从表3看出，紫云冰脆李果皮和混合样中均检测到4种B族维生素，不同B族维生素含量差异较大，均以维生素B12含量最高，分别为33.53 μg/g和36.99 μg/g；维生素B2最少，分别为0.44 μg/g和0.61 μg/g。B族维生素果皮与混合样均呈显著性差异，其中，果皮B6显著高于混合样，B1、B2和B12均显著低于混合样，均依次为维生素B12>维生素B1>维生素B6>维生素B2。表明，紫云冰脆李B族维生素主要以B12为主，同时含有维生素B1、B2和B6，除果皮维生素B6高于混合样外，其余均低混合样。

表3 紫云冰脆李果实B族维生素含量Table 3 Content of different B vitamins components in fruits of Ziyun Plum

3 讨论

研究表明，在紫云冰脆李果皮中共检测出果糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇和蔗糖5种可溶性糖，在混合样中检测出果糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖4种，其中，果皮以葡萄糖和果糖为主，总量为44.15 mg/g，与李鹏等[7]所测得的黑珍珠李果皮葡萄糖和果糖总量有差异；混合样以蔗糖和葡萄糖为主，总量为53.48 mg/g，与赵树堂等[10]的研究结果相似，但蔗糖含量低于刘硕等[8]检测的中国李品种“奎丰”“美丽”及杏李品种“香蕉李”和“香扁李”的蔗糖含量。山梨醇与植物抗逆性密切相关[11]，研究结果显示，山梨醇主要存在于果皮中，为5.44 mg/g，混合样中未检出，其对紫云冰脆李是否有抗性贡献有待于进一步研究。紫云冰脆李果皮和混合样均检测出苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和莽草酸6种有机酸，表明紫云冰脆李含有的有机酸较为丰富，果皮和混合样总酸分别为10 777.54 μg/g和7 564.33 μg/g，与王小红等[6-8]的研究结果有所差异；有机酸均以苹果酸为主，分别占果皮和混合样总酸的87.66%和87.38%，与巫伟峰等[5-7,10,12]的研究结果一致，表明，紫云冰脆李属于苹果酸型果实，果实酸度主要由苹果酸含量决定。紫云冰脆李果皮和混合样均检测到维生素B1、B2、B6和B124种B族维生素，均以B12含量最高，分别为33.53 μg/g和36.99 μg/g。B族维生素有利于人体健康，如维护神经系统健康抗抑郁症[13]、抗结肠癌[14]、改善糖尿病[15]和镇痛[16]等。人体不能合成B族维生素，主要从食物中摄取，易受光、热、空气等破坏分解[17-18]，不易保存。因此，紫云冰脆李是一种富含维生素B12的营养水果，是B族维生素的天然贮藏库，且食用方便

4 结论

HPLC法可较好地分离紫云冰脆李果皮和混合样品的可溶性糖、有机酸和维生素组分。其中，紫云冰脆李可溶性糖主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇，果皮以葡萄糖含量最高，果糖次之，共占总糖的66.41%；混合样以蔗糖含量最高，葡萄糖次之，共占总糖的59.72%。有机酸主要有苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和莽草酸，果皮和混合样均以苹果酸为主，分别占总酸的87.66%和87.38%。B族维生素主要包括维生素B1、B2、B6和B12，果皮和混合样均以维生素B12含量最高，分别为33.53 μg/g和36.99 μg/g，其中，除果皮维生素B6显著高于混合样外，维生素B1、B2和B12均显著低于混合样。综合看，紫云冰脆李是以苹果酸为主要有机酸的李品种，具有果皮葡萄糖含量高、混合样蔗糖含量高及果皮和混合样维生素B12含量高的特点。