DBD 等离子体灭活水中的金黄色葡萄球菌生物膜研究

唐燕丹 许子牧

（合肥工业大学资源与环境工程学院，安徽合肥 230009）

1 引言

水的卫生安全直接关系到人体健康［1］，饮用水分配系统（DWDS）在饮用水行业中发挥着重要的传递作用。然而各种病原微生物通过形成稳定的生物膜可以牢固地附着在DWDS 中，其不但分泌有机质腐蚀管道、污染水质，而且解体后通过流动水体不断传播影响千家万户，从而导致潜在的疾病感染［2］。另外，生物膜相对单一悬浮细菌呈现出更复杂的特性，其往往是多种细菌混杂在一起，其相比悬浮细菌更难灭活和根除。因此，对DWDS 中致病微生物膜的处理显得尤为重要［3］。传统的灭菌方法在水质复杂、污染物种类多的情况下有一定的局限性，对环境和公共卫生等会产生不利影响。因此，找到一种高效灭活细菌生物膜的方法，对DWDS 净化消毒具有重要意义。

低温等离子体作为高级氧化技术（AOPs）的一种，在有机物降解和细菌灭活方面引起了广泛关注［4］。等离子体放电可产生自由基等活性组分，这些物质直接与致病微生物发生反应，快速灭活，且不会产生有毒有害的副产品［5-6］，因此等离子体在灭活致病微生物方面具有很大的潜力。

金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜是革兰氏阳性病原菌中最常见的自然存在形式之一，易在自来水运输管道中形成并污染水源［7-8］。本研究以S.aureus生物膜为研究对象，研究DBD 等离子体对S.aureus生物膜的灭活效果，以期为DBD 等离子体应用于真实水体中灭活S.aureus 生物膜提供参考。

2 材料和方法

2.1 试剂和仪器

菌株和试剂：S.aureus 为安徽医科大学附属医院赠予；LB 肉汤；刃天青（Resazurin）染料（Sigma，USA）；胞内活性氧检测试剂盒（Beyotime，China）。

仪器：高压电源；酶标仪（Thermo－Fisher Scientific，USA）；纯水机；振荡器；电热恒温培养箱；PhotoLab6100分光光度计。

2.2 实验装置

实验时将制备好的生物膜置于图1 所示的DBD等离子体装置底部，当DBD 等离子体放电产生的活性物质通过底部的小孔以气泡的形式在溶液中扩散，S.aureus 生物膜会与溶液中活性物质反应。

图1 DBD 等离子体装置

2.3 分析方法

2.3.1 放电电流与电压检测

使用示波器测量DBD 等离子体放电电流、电压，功率计算公式如下［9］：

式中，P 代表放电功率，W；T 代表放电周期，s；U 代表放电电压，V；I 代表放电电流，A；f 代表放电频率，Hz；C 代表电容，F；S 代表李萨如图形面积。

2.3.2 长寿命活性物质检测

过氧化氢（H2O2）浓度采用H2O2含量检测试剂盒（AKAO009C，Beijing Boxbio Science＆Technology Co.，Ltd，China）通过分光光度法测定。NO3－和NO2－浓度采用检测试剂盒（MERCK，09713，00609，Germany）通过分光光度计（photolab 7100，WTW，Germany）测定。

2.3.3 DBD 等离子体灭活生物膜

将长满S.aureus 生物膜的细胞爬片放入DBD等离子体射流反应器底部，放电处理后提取出细胞爬片，并放入含有2 mL 无菌水的离心管中。用无菌平端刮刀刮除菌体表面的生物膜放进离心管里。离心管随后被浸入45 kHz 超声波中水浴3 min，然后10 s 涡旋，以确保完全取下生物膜，不会影响细胞活力。将菌悬液梯度稀释适当倍数，采用LB 固体培养基进行生物膜的细菌计数，1 式3 份。在37 ℃下孵育过夜，形成菌落单位（CFU）。

2.3.4 新陈代谢能力检测

使用Resazurin 的体外毒理学检测试剂盒（Sigma－Aldrich，USA）来测量S.aureus 的代谢能力。取100 μL等离子体处理或未处理的S.aureus 悬浮液（作空白对照）分别移入96 孔板（1 个样品/孔），将2.3.3 中取下的生物膜悬液移入96 孔板（1 个样品/孔），并在每孔中加入100 μL 的Resazurin 染料溶液（10%）。100 μL 无菌水加入100 μL 的Resazurin 染料溶液（10%）为阴性对照。在37 ℃的黑暗环境下，将孔板孵化3 h。用Varioskan Flash 标准微板阅读器（Thermo－Fisher Scientific，USA）在560/590 nm 的波长下检测每个样品悬浮液的荧光强度。用无菌水加Resazurin作为对照。

2.3.5 细胞内活性氧

在本实验中，使用荧光探针2′，7′－二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH－DA）来检测活性氧的含量。将按要求稀释后的试剂和待测菌液各取1 mL 并混匀后于37 ℃培养箱中静置25 min，然后置于酶标仪（激发/发射波长为488/525 nm）检测荧光强度。

3 结果与讨论

3.1 放电特性

S.aureus 生物膜的灭活效率与DBD 等离子体的放电电压以及功率有密切关系。图2 为DBD 等离子体在放电时测得的电流电压波形图。从图2 中可看出，峰值电压和电流分别达到了9 kV 和0.18 A。

图2 DBD 等离子体产生时的电流电压波形图

DBD 等离子体产生时的李萨如图形见图3。

图3 DBD 等离子体产生时的李萨如图形

由图3 可见，李萨如图形出现了许多不规律的毛刺，这主要是因为用于放电的电压是个定值，DBD放电又是暴露于空气中放电，放电时不可避免地会因为气流的流动以及气液面的轻微抖动，使得放电过程不是完全稳定。因此，李萨如图形曲线不光滑。由这个李萨如图形可求出等离子体放电产生的功率为47.2 W。

3.2 活性组分含量

等离子体放电会产生很多活性物质，这些活性物质很可能是等离子体能够灭活细菌的原因。这些活性物质产生的反应式如下［10-12］（“*”代表水分子带一个正电荷）：

H2O+e-→H2O*+2e-

H2O+H2O*→H2O-+·OH

2·OH→H2O2

N2+e-→2N·+e-

N·+O·→NO·

NO·+O·→NO2·+e-

NO2·+·OH→HNO3

NO·+·OH→HNO2

本研究对DBD 等离子放电过程中产生的长寿命活性物质H2O2，NO3－，NO2－的浓度进行了检测。图4反映了DBD 等离子体对纯水放电时，DBD 产生并溶于水中的H2O2，NO3－，NO2－，其浓度随放电时间的延长而增大，24 min 时其浓度分别达到了0.94，8.23，22.32 mg/L。

图4 H2O2，NO2－和NO3－含量随DBD 等离子体处理时间的变化情况

3.3 灭活生物膜

采用平板计数法检测DBD 等离子体灭活S.aureus 生物膜的效果。DBD 等离子体处理S.aureus生物膜后细菌存活情况见图5。

图5 DBD 等离子体处理S.aureus 生物膜后细菌存活情况

由图5 可知，随着等离子体放电时间延长，生物膜中存活的细菌数量逐渐降低。当等离子体处理12.0 min 时，生物膜中存活的细菌数量下降了大约1.0个数量级。而当等离子体处理时间延长到24.0 min时，大约有3.2 个数量级的细菌被灭活。Xu 等［13］研究发现，活化水灭活生物膜的效率随着活化水浸泡时间的增加而增加，用等离子体放电0.5 h 产生的活化水浸泡S.aureus 生物膜0.5 h 后，使S.aureus 生物膜细菌降低了2.2 个数量级。本实验灭菌效果较好，可能是由于DBD 等离子体直接处理水溶液中的生物膜，放电产生的长寿命物质于胞内活性物质共同作用的结果。

3.4 新陈代谢能力

DBD 等离子体处理后具有新陈代谢能力细菌所占百分比见图6。

图6 DBD 等离子体处理后具有新陈代谢能力细菌所占百分比

如图6 所示，随着DBD 等离子体处理时间的延长，将会导致生物膜内具有新陈代谢能力的细菌比例逐渐下降，与生物量和细菌数的变化一致，即生物膜形成能力弱、细菌数较少的代谢能力也相对较弱，表明DBD 等离子体射流在灭活生物膜的同时，对细菌代谢也有一定的抑制作用。同时，由于微生物新陈代谢等活动与相关酶的作用密切相关，等离子体放电产生的活性物质可能会影响酶的活性，从而导致其代谢能力下降。

3.5 胞内活性物质（ROS）含量

DBD 等离子体处理S.aureus 生物膜后胞内ROS含量变化见图7。

图7 DBD 等离子体处理S.aureus 生物膜后胞内ROS 含量变化

如图7 所示，等离子体放电处理3.0 min 可分别使得S.aureus 胞内相对ROS 水平增加14.9±8.6%，增加未超过1.2 倍，处于较低的水平。在细胞正常代谢过程中，ROS 的产生是一种正常的生理过程。ROS可以作为信号分子或者二级信使，调节细胞基因表达，且激发细胞体内的抗氧化系统，以此来减少外界氧化损害，从而在面对环境压力的时候起到保护作用。而在持续的外界压力情况下，细胞内ROS 浓度大幅度提高，会破坏细胞内的组分。实验表明，在一定的时间内，DBD 等离子体处理可引起S.aureus 胞内ROS 水平的大量升高，且随着放电时间的增加，ROS 水平增加也相应更明显。等离子体处理12.0 min后，胞内相对ROS 提高51.1±14.2%，说明DBD 等离子体射流处理一定时间可导致S.aureus 胞内ROS的积累。有研究表明，DBD 直接处理S.aureus 会氧化细胞外部结构，而且会引起胞内ROS 的升高，破坏细胞内膜和其他结构分子，导致生理功能破坏，最终细菌死亡。0～24.0 min 内的ROS 上升规律与S.aureus生物膜的灭活率保持一致，说明胞内ROS 含量与细胞死亡正相关。而且随着放电时间增加，两种体系中活性物质含量也逐渐升高，在细胞内外共同对细菌结构产生氧化作用，促进细菌失活。因此，等离子体放电引起S.aureus 生物膜细菌胞内ROS 升高是灭菌的重要原因。

4 结论

DBD 等离子体处理水中S.aureus 生物膜24.0 min后，生物膜中细菌量失活了102.2CFU/mL。经DBD 等离子体处理后溶液中的长寿命活性物质含量均有不同程度的提高，S.aureus 生物膜中细菌的新陈代谢能力与未经等离子体处理时相比降低了78.5%，细菌胞内ROS 含量与处理时间为0 min 时相比增加了70.2%。另外，随着放电时间的延长，S.aureus 胞内ROS 的含量持续增加，等离子体放电产生的活性基团与细胞内ROS 协同作用可能是造成S.aureus 生物膜细菌失活的主要原因。综上所述，DBD 等离子体是一种高效灭活S.aureus 生物膜的方法，有望在实际水体灭菌时应用。