酵母菌的磁性载体固定化及处理精炼大豆油废水

吴 松

(大唐东北电力试验研究院有限公司,吉林 长春 130102)

大豆油在精炼过程中会产生大量有机负荷比较高的废水，此类废水直接排放会降低水中溶解氧，加重水体自净化负担，使水质富营养化，严重污染环境，对人们生活造成危害[1-3]。精炼大豆油废水的特点：一是有机物含量较高，其中油脂难溶于水且黏度较高，易生成乳化液，难生物降解；二是有毒物质少，可生化性好[4]。因此，目前针对大豆油精炼过程中产生的废水，国内一般通过预处理去除悬浮物和乳化态油，再通过生化处理去除溶解态油和剩余有机物，使其达标排放[5]，但是该处理工艺存在投资成本高、占地面积广、工艺复杂且会造成二次污染等缺点。为了解决传统生物处理技术存在的问题，近年来采用固定化技术，通过一定的技术手段(如载体材料，包埋材料或合理控制水力条件)固定微生物。固定化微生物技术是利用物理或化学手段将微生物固定在载体上，使其高度致密并保持其生物活性，在适当条件下也可扩大生产规模以满足生物技术应用的需要[6]。微生物固定化方法一般分为吸附法[7]、交联法、包埋法[8]、介质保留法和多种固定化组合方法如复合固定化方法[9]等。Pai等[10]研究了在高负荷条件下固定化微生物滤床对苯酚的降解，结果表明：与颗粒状活性炭相比，以海藻酸钙为载体的固定化活性炭颗粒对苯酚具有较高的降解率。周相林等[11]比较了游离细胞与固定化细胞降解氰的某些特征，发现细胞经固定化后热稳定性明显提高。因固定化微生物稳定性高、重复利用性好，故固定化微生物技术有望成为处理含油废水的新型高效方法。磁性载体又称磁性微球或磁种，是由超顺磁性纳米粒子与高分子或其它无机材料复合形成的胶态颗粒。磁性微粒作为一种磁性载体在酶固定、细胞分离与固定、靶向载药治疗及核酸的纯化与分离等生物医学领域得到了广泛的应用[12]。近几年来，对于磁场效应在废水生物降解中的应用研究有大量的报导。水经磁化处理后，其物理与化学性质会发生变化，磁场的作用能提高微生物的生物活性，增加微生物对废水有机污染物的吸附和利用能力，因而提高了污水生物净化效果[13]。固定在磁性载体上的酶和微生物细胞存在较大的pH值和温度范围，且稳定性更高。多种酶活生物细胞的共固定化也可以通过基于磁性载体的固定方法来完成[14]。磁分离技术可以使磁性载体与被吸附物质更易分离，该吸附剂是由微生物、海藻酸钠、聚乙烯醇和四氧化三铁组成，该吸附剂在去除和回收废水中的重金属方面具有潜在价值[15]。本研究利用磁性载体和海藻酸钠固定的酵母菌对精炼大豆油废水进行处理，并对废水处理条件进行优化，以期为精炼大豆油废水的生物处理提供新思路。

1 实 验

1.1 材料与仪器

发酵性丝孢酵母(TrichoporonfermantansCICC 1368)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。实验所用试剂均为市售分析纯。

为了实验的可控性和操作简便，本研究使用的废水是根据取自吉林省某豆油生产加工厂的精炼大豆油废水水质分析结果而配制的模拟废水。精炼大豆油原废水和模拟废水水质分析情况见表1。

表1 精炼大豆油产生的废水和模拟废水水质

571型COD测定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；722型分光光度计，渡扬精密仪器(上海)有限公司；D8Advance XRD衍射仪，广州创仪欣仪器有限公司。

1.2 酵母菌的磁性载体固定化

1.2.1培养基的制备 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，作为液体种子培养基。在液体种子培养基中加入琼脂粉15 g/L作为固体培养基。

以上培养基均在1×105Pa饱和蒸汽下灭菌20 min。

1.2.2菌种的保藏和活化 菌种保藏：从培养菌种的固体YPD中挑取单菌落，接种到装有100 mL 液体YPD的250 mL摇瓶中，30 ℃下150 r/min摇床培养24 h；然后将菌种液保存于浓度为20%的甘油中，于-80 ℃下冻存。

菌种活化：从冰箱中取出保藏菌种，划线接种到YPD固体培养基，30 ℃ 下恒温培养24～48 h，为本研究提供酵母菌。

1.2.3磁性载体的制备 采用化学共沉淀法制备水溶性的磁性载体Fe3O4纳米颗粒，具体步骤如下：用去离子水分别配制1.0 mol/L的FeCl2和1.75 mol/L的FeCl3水溶液各50 mL，加入到500 mL的三口瓶中，通入氮气进行保护，持续机械搅拌，当水浴加热至60 ℃时快速滴加氨水(质量分数25%～28%)至pH值10～11，溶液由棕色变为黑色即可。再升温至80 ℃恒温保持1 h后室温冷却，用永久磁体将产物从溶液中分离，用蒸馏水反复洗至中性，在室温下真空干燥24 h，制得Fe3O4纳米颗粒。

1.2.4酵母菌的固定化 酵母菌悬液的配置：用接种环将固体培养基上发酵性丝孢酵母的一株单菌落接入到100 mL无菌的YPD中，在30 ℃ 摇床上以180 r/min培养1天，得到培养好的酵母菌悬液，存放在4 ℃ 冰箱中，备用。

海藻酸钠固定化酵母菌：用100 mL蒸馏水加热溶解10 g海藻酸钠，将10 mL酵母菌悬液与100 mL配制好的海藻酸钠溶液充分混合均匀，形成海藻酸钠-酵母菌悬液[16]。然后称取3.00 g无水氯化钙，溶于150 mL蒸馏水中，配制成所需质量分数(2%)的氯化钙溶液，将其置于设定温度(20 ℃)的电子恒温水浴锅中，将100 mL海藻酸钠-酵母菌悬液滴入150 mL氯化钙溶液中造粒，并恒温维持2 h，使酵母充分固定化。倾去上清液，用蒸馏水冲洗固定化酵母3次，然后重新置于150 mL 2%的氯化钙溶液中平衡24 h后，悬液备用[16]。

磁性载体固定化酵母菌：取10 mL酵母菌悬液，加入5 g的磁性载体Fe3O4纳米颗粒，于摇床中恒温(30 ℃、 150 r/min)摇动一定时间，悬液备用[17]。

1.3 精炼大豆油产生的废水处理

本研究中所有废水处理均在250 mL摇瓶中进行，分别将适量酵母菌、磁性载体、海藻酸钠固定化酵母菌和磁性载体固定化酵母菌与100 mL模拟废水在温度30 ℃，转速150 r/min下培养48 h。实验中分别考察了处理时间(0～48 h)对废水水质以及酵母菌生长情况的影响，废水的pH值(5.0～7.5)对废水中酵母菌的生产情况以及酵母菌接种量(0～10%)对废水的COD值的影响。

1.4 分析与测试

OD600的测定：利用可见分光光度计722型测量湿菌体在600 nm处的吸光度，以判断酵母菌生长情况。

废水COD值的测定：由于COD测定仪的上限为150 mg/L，待测样品需要用去离子水稀释至适宜浓度。取2 mL稀释后的待测样品放入COD消解管中，加入3 mL重铬酸钾专用氧化剂，拧紧管帽将液体摇匀，将消解管放入消解装置中，165 ℃消解10 min，冷却至室温，把消解结束后的样品倒入石英比色皿中，放入COD测定仪进行测量。

XRD分析：对磁性载体的结构组成采用XRD进行定性分析。测量时称取15～25 mg磁性载体置于样品台上，用盖玻片和称量纸压平，擦去样品台表面多余的磁性载体粉末后放至衍射仪的上样器上测量。衍射仪的发生器功率为40 kV，其射线源为Cu Kα射线，扫描范围(2θ)为20～80°，扫描速度5 (°)/min，扫描步长0.05°。

2 结果与讨论

2.1 磁性载体的表征

采用化学共沉淀法制备的Fe3O4的XRD图谱见图1。可以看出，在2θ为18.2°、 30.0°、 35.4°、 43.0°、 56.9°及62.5°处均出现强衍射峰，分别对应于Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(400)、(511)及(440)晶面，说明所得的产物为立方晶系结构的Fe3O4，即FeO(Fe2O3)。结合其衍射峰尖锐且半峰宽窄，证明所制备的Fe3O4结晶度高，具有尖晶石结构，晶型好，无其他衍射峰存在。

图1 四氧化三铁纳米晶体粒子的XRD图谱Fig.1 XRD pattern of Fe3O4 nanocrystalline particles

2.2 精炼大豆油废水的固定化酵母菌处理

2.2.1不同处理时间对废水水质的影响

2.2.1.1酵母菌处理废水 酵母菌(1.2.4节酵母菌悬液)处理精炼大豆油废水时，在接种量10%，其它条件同1.3节，不同处理时间对废水pH值和COD值，以及酵母菌OD600值的影响情况见表2。

由表可以看出，随着酵母菌处理时间的增加，废水的pH值先减小后增加，在0～12 h范围内pH值的减小是因为酵母菌在处理含油废水时产生了脂肪酸，而12 h后废水pH值随着废水中脂肪酸被消耗逐渐增大，在36 h后保持稳定。由此可见，当废水中的菌体浓度较高时，发酵性丝孢酵母可以直接利用废水中的物质。酵母菌的OD600值随处理时间增加呈上升趋势，12 h之后酵母菌的OD600值迅速增大，这是因为酵母菌这时处于对数生长期，菌体的增长量急速上升而导致酵母菌的OD600值增大。废水的COD值在24～36 h急速下降，36 h时废水的COD值为3 630 mg/L。一般来说，COD值小于5 000 mg/L，就是理想的处理效果。可见这个时间段酵母菌对废水处理的效果最好。

2.2.1.2磁性载体处理废水 利用磁性载体对精炼大豆油废水进行处理时不考虑酵母的生长情况(OD600值)。在1.3节条件下，5 g磁性载体处理精炼大豆油废水时，不同处理时间对废水pH值和COD值的影响情况见表2。

表2 处理时间对精炼大豆油废水水质的影响

由表可以看出，随着处理时间的延长，pH值变化不大。这是因为酵母菌的生长会产生脂肪酸从而导致废水的pH值发生大幅度变化，而磁性载体处理废水过程中无酵母菌参与，因此，废水的pH值变化不大。通过分析COD值可知：0～24 h磁性载体对废水的处理几乎没有效果，而24～36 h废水的COD值急速下降，这是因为在此时间段内，由于搅拌作用，磁性载体经过一段时间摇瓶振动混合，对废水中的物质有一定吸附能力，经磁性载体处理36 h，废水的COD值为6 530 mg/L。

2.2.1.3固定化酵母菌处理废水 按照1.3节操作，不同处理时间下，接种量10%的海藻酸钠固定化酵母菌和磁性载体固定化酵母菌处理精炼大豆油废水的结果见表3。

表3 固定化酵母菌处理对精炼大豆油废水水质的影响

由表可看出, 不管是海藻酸钠固定化酵母菌处理还是磁性载体固定化酵母菌处理，废水的pH值均随着酵母菌处理时间的增加先减小后增加。0～12 h废水的pH值减小，这是因为酵母菌在此阶段处理含油废水时产生了脂肪酸。而12 h后pH值逐渐上升，在36 h后保持稳定，这是因为该阶段酵母菌的生长量急剧上升，会消耗脂肪酸，当菌体生长量一定时，pH值变化缓慢。由此可见，初始菌体浓度较高时，发酵性丝孢酵母可以直接利用废水中的物质。酵母菌的OD600值变化在0～24 h增长速度较为缓慢，24 h之后迅速增长。这是因为24 h属于酵母菌的对数生长期，此时菌体的增长量急速上升，从而导致OD600值的迅速变大。而废水的COD值，经过海藻酸钠固定化酵母菌处理的废水，在0～36 h，由于酵母菌对废水的降解能力稍微缓慢，COD值变化不大，而在36～48 h，废水的COD值急速下降，48 h时COD值为4 580 mg/L。而经过磁性载体固定化酵母菌处理的废水，在0～24 h，由于酵母菌对废水的降解能力稍微缓慢，COD值变化不大；在24～36 h，废水的COD值急速下降，36 h时COD值为2 430 mg/L。由此可见，相同条件下磁性载体固定化酵母菌处理精炼大豆油废水效果最佳，且合适的处理时间为36 h。

2.2.2不同pH值对废水水质的影响 由于酵母的生长与废水的pH值密切相关，因此本节主要考察pH值对酵母菌OD600值的影响。在1.3节条件下，接种量10%的酵母菌和固定化酵母菌处理精炼大豆油废水的结果见图2。

a.酵母菌处理treated by yeast; b.海藻酸钠固定化酵母菌处理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由图2(a)可以看出，无论废水pH值如何变化，酵母菌的OD600值总是随着时间的增长而增大。在pH值为5.0和5.5时，处理12 h的废水中的酵母菌的OD600值较大，但是处理24和36 h时的废水中的酵母菌的OD600值均小于pH值为6.0时的酵母菌的OD600值。且随着pH值的增加，12 h的OD600值是逐渐减小的，也就是说酵母菌生长前期废水的pH值越高，会影响酵母的正常生长；而24和36 h的OD600值先略有增大而后减小，这是因为在酵母的生长中期和生长末期，过小和过大的pH值都会影响酵母的正常生长。pH值为6.0时，废水处理12、 24和36 h时，废水中的酵母菌的OD600值较高，分别为5.88、 13.74和19.20，可见丝孢酵母菌适合在此pH值下生长。

由图2(b)可以看出，经海藻酸钠固定化酵母菌处理12和24 h的废水中的酵母菌，在pH值大于6.5或小于6.0时的生长情况都要优于pH值为6.0～6.5，但是处理36 h的废水中的酵母菌的OD600值却是先增大后减小。这是因为酵母菌经过海藻酸钠固定化后生长性质发生了变化。由此可见，对于海藻酸钠固定化酵母菌，在其生长前期，废水呈弱酸性会影响12和24 h的酵母菌的正常生长，而在酵母菌的生长初期和生长中期，废水呈酸性或者碱性，则对36 h的酵母菌的正常生长有促进作用。由此可见，海藻酸钠固定化酵母菌处理36 h的废水中，酵母菌在pH值5.5时生长量最大，OD600值为19.12。

由图2(c)可以看出，经磁性载体固定化酵母菌处理精炼大豆油废水中的酵母菌，随着pH值的增加，12 h的酵母菌的OD600值是波动变化的，也就是说生长前期废水的pH值变化对酵母的正常生长影响较小；而24和36 h的酵母菌的OD600值，变化总趋势是先增大后减小，即在酵母的生长中期和生长末期，过小和过大的pH值都会影响酵母菌的正常生长。pH值6.0比较适合磁性载体固定化酵母菌的生长，12、 24和36 h的酵母菌的OD600值分别为5.14、 10.25和19.78。

综上，处理精炼大豆油废水36 h时，废水中磁性载体固定化酵母菌的OD600值最高，达到19.78，而发酵性丝孢酵母和海藻酸钠固定化酵母菌的OD600值分别为19.20和19.12。

2.2.3不同接种量对废水水质的影响 由于废水的处理效果与酵母菌的接种量密切相关，因此本节主要考察酵母菌接种量对废水COD值的影响。

在1.3节条件下，酵母菌和固定化酵母菌处理精炼大豆油废水(pH值6)时，接种量对废水COD值的影响情况见图3。

a.酵母菌处理treated by yeast; b.海藻酸钠固定化酵母菌处理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由图3(a)可知,酵母菌接种量大于4%时，废水的COD值随着处理时间的增加，出现先减小后增加的趋势，这可能是因为接种量过大，影响酵母处理废水的效果。而当接种量为4%，经酵母菌处理的废水COD值随时间增大而减小，处理时间为36 h时，COD值最小，为3 630 mg/L。

由图3(b)可知, 废水COD值随着海藻酸钠固定化酵母菌接种量的增加发生变化。接种量为4%和6%时，废水的COD值随着处理时间的增加均为先减小后增加。接种量为8%时，废水的COD值虽然随着处理时间的增加逐渐减小，但是COD值仍然较大，废水处理效果不佳。而当接种量为10%、处理时间为12 h时，废水的COD值最小，为4 580 mg/L。

由图3(c)可知, 磁性载体固定化酵母菌处理精炼大豆油废水时，废水COD值随着接种量的增加，除处理时间12 h的之外，24和36 h的均整体呈下降趋势。接种量为8%时，精炼大豆油废水的COD值随处理时间的增加逐渐减小，处理36 h的废水COD值为9 840 mg/L，但是仍然较大，废水处理效果不佳。当接种量为10%、处理时间为36 h时，磁性载体固定化后的酵母菌对废水的处理效果最好，废水COD值最小，为2 430 mg/L。

综上，通过对比分析可知，相同条件下磁性载体固定化酵母菌处理精炼大豆油废水的COD值最佳。

3 结 论

3.1 先采用化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米磁性材料，再对酵母菌进行固定化，并用磁性载体固定化酵母菌对精炼大豆油废水进行处理，并与海藻酸钠固定化酵母菌和丝孢酵母菌处理废水结果进行对比，结果显示：在相同条件下，酵母菌、磁性载体、海藻酸钠固定化酵母菌和磁性载体固定化酵母菌4种物质中，磁性载体固定化酵母菌对精炼大豆油废水处理36 h时效果最佳。废水中酵母菌的生长量最大，OD600值为19.12。pH值6.0比较适合磁性载体固定化酵母菌的生长，处理36 h的废水中的酵母菌的OD600值为19.78。

3.2 磁性载体固定化酵母菌对精炼大豆油废水进行处理的较优条件为pH值6.0，处理时间36 h，接种量10%。此条件下，废水的COD值为2 430 mg/L。