油茶皂素脱色及色泽评价方法比较研究

肖志强， 刘传杰， 陈殿松， 蒋建新*

(1.北京林业大学 材料科学与技术学院，北京 100083； 2.广州德谷个人护理用品有限公司，广东 广州 510000；3.国家林业和草原局木本香料(华东)工程研究中心，江西 南昌 330045)

茶皂素又名茶皂苷，是山茶科植物中含有的一类糖苷类物质，由糖体、皂苷元(配基)和有机酸三部分组成的结构复杂的五环三萜化合物[1-2]。茶皂素是一种性能良好的非离子表面活性剂，具有起泡、分散和乳化等作用，且具有抑菌、溶血、抗癌和抗炎等生理活性，在生产各类乳化剂、洗涤剂和杀菌剂等领域有广泛应用[3-6]。目前油茶皂素的提取方法主要是水提法和醇提法[7]，这两种方法具有工艺简单、成本低和污染小等特点，但得到的茶皂素往往纯度不高[8]，含有黄酮、多酚、蛋白质和色素等杂质，导致茶皂素的色泽较深，进而影响茶皂素在洗发香波等中高档产品中的应用。因此工业生产中要对茶皂素进行脱色，从而拓宽茶皂素的应用领域。传统的物理吸附脱色方法对油茶皂素并没有很好的脱色效果，甚至会由于吸附剂的无选择性导致目标产物的损失[9]。过氧化氢能通过产生高反应性氧化剂羟基自由基与自由物发生反应，达到漂白作用[10]。凹凸棒土是一种富含镁铝硅酸盐黏土矿物，其特有的纤维状或棒状晶体形态使其具备了较大的比表面积和良好的吸附性能，有研究表明，凹凸棒土有较强的吸附脱色功能[11]。目前相关领域对皂素的色泽评价方法仅停留在类似色阶比色计分析等较浅层次的阶段，不同茶皂素色泽评价方法的优劣之处也未见有系统且深层次的研究。而对茶皂素进行系统且合理的色泽评价至关重要，因为不同的色泽评价方法在同一样品的研究中可能产生不同的结果。因此,开展茶皂素色泽评价方法的建立势在必行。本研究采用过氧化氢/凹凸棒土耦合体系对油茶皂素进行脱色，探究最适宜茶皂素脱色的条件，并通过比较不同的颜色评价方法，为茶皂素的色泽鉴定奠定实验基础，以期为今后油茶皂素的工业化生产应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

油茶皂素(纯度40%，粒径约0.075 mm)，产自浙江；过氧化氢溶液(30%)，氢氧化钠和盐酸，均为市售分析纯；凹凸棒土(纯度≥95%，粒径约0.075 mm)，常州鼎邦矿产品科技有限公司。

LGJ-12冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；UV- 6100A紫外可见分光光度计，上海比朗仪器有限公司；FE28 pH计，瑞士梅特勒公司；分光辐射亮度计(PR715)，美国Photo Research公司；WSL系列罗维朋比色计，上海仪电物理光学仪器有限公司；SONY CORP系列数码相机，日本SONY公司。

1.2 实验方法

1.2.1油茶粗皂素预处理 油茶粗皂素经无水乙醇在料液比1 ∶10(g ∶mL)、 70 ℃下纯化1 h，离心除去蛋白质和多糖等水溶性物质，同一批粗皂素纯化3次，旋蒸浓缩，真空干燥后得到纯化皂素。将此纯化皂素作为后续脱色实验的原料。纯化皂素得率为(42.08±0.68)%，纯度根据香草醛浓硫酸法测得为(60.20±1.32)%。实验时做两组平行实验，取平均值。纯化皂素得率根据式(1)计算。

Y1=m1/m×100%

(1)

式中:Y1—纯化皂素得率，%；m1—浸提后皂素总质量，g；m—浸提前粗皂素质量，g。

1.2.2皂素的脱色 用去离子水将纯化后的茶皂素配置成质量分数5%的皂素溶液(用10%的氢氧化钠将溶液pH值调至10)，加入一定量的过氧化氢溶液，加热反应一段时间，反应完后取出锥形瓶，用盐酸将溶液pH值调至4.39(原料溶液的pH值)，再加入凹凸棒土吸附25 min，最后取出溶液于4 000 r/min 离心15 min，离心后的上清液稀释成1%的溶液在分光光度计下测定吸光度，然后浓缩、冷冻和干燥制得脱色皂素，保存至干燥器中，用作其他色泽评价。实验时做两组平行实验。脱色皂素的得率根据式(2)计算。

Y2=m2/m3×100%

(2)

式中：Y2—脱色皂素得率，%；m2—脱色后皂素质量，g；m3—脱色前皂素质量，g。

1.2.3正交试验 在实验室前期研究的基础上，采用正交试验法优化油茶皂素脱色条件。选择H2O2用量4%～8%，脱色温度60～80 ℃，脱色时间1～3 h，凹凸棒土用量1%～3%(以脱色前皂素质量计)，以分光光度计(510 nm)的脱色率为指标，每个条件均进行两次平行试验。

1.3 颜色的评价

1.3.1分光光度计法 将脱色后的皂素稀释成质量分数1%的溶液，以去离子水为空白，分别在510和480 nm波长下利用分光光度计测量其吸光度值(所测吸光度值均在0.2～1.0之间)，脱色率根据式(3)计算。

η=(A0-A1)/A0×100%

(3)

式中：η—脱色率，%；A0—1%原料在一定波长下的吸光度,510 nm下A0=0.676 0,480 nm下A0=0.797 6；A1—脱色后皂素溶液在一定波长下的吸光度。

1.3.2分光辐射亮度计法 参考严俊等[12]的方法，使用分光辐射亮度计进行颜色测定，并将测定记录的数据(L*、a*和b*值)进行综合分析。L*值是颜色的明度值，表示色彩的明暗度，其范围从0到100，值为0时明度最低，值为100时明度最高。a*、b*值是色彩的色度值，其中a*值从红(正值)到绿(负值)渐变，b*值则由黄(正值)到蓝(负值)渐变。其中L*值是衡量亮度的一个重要的指标，故使用L*值作为脱色效果的衡量标准。脱色率根据式(4)计算。

(4)

式中：L0*—皂素脱色前的明度值；L1*—皂素脱色后的明度值。

1.3.3罗维朋比色计法 将5%的脱色后的皂素溶液注入比色皿中，再把比色皿放到比色箱的槽里即可开始测量(使比色皿紧贴色片盒窗口)，通过观察目镜，移动仪器配套的罗维朋滤色片使比色箱内两视场的颜色保持一致，记录此时的滤色片数据。采用配套的比色皿尺寸(nm)为10×20×40。脱色率根据式(5)计算。

η=(R0-R1)/R0×100%

(5)

式中：R0—脱色前皂素的罗维朋红度值，数值为2.0；R1—脱色后皂素的罗维朋红度值。

1.3.4直观观察拍照法 将脱色后的皂素研磨后过0.425 mm筛，称取0.48 g样品，为了杜绝普通玻璃反光导致的色度不均一，放置于定制的带圆槽的石英比色皿中并将其紧压，最后采用SONY CORP系列相机在同一光照环境下对冻干样品进行拍照。

1.3.5色阶比色法 制备标准色阶比色卡，将脱色后的皂素和纯化皂素进行比色。表1为制备的标准色阶比色卡。图1为制备的标准色阶比色卡颜色变化。

表1 标准色阶比色卡

图1 标准色阶比色卡颜色变化

2 结果与分析

2.1 脱色正交试验结果分析

在此最优条件下进行2组验证试验，510 nm下脱色率为78.99%和80.04%，平均值为79.52%，脱色效果显著，证明该优化条件可行。

表2 油茶皂素脱色情况的正交试验结果

2.2 颜色测定结果

2.2.1分光光度计法 分光光度计法是一种基于朗伯比尔定律原理的颜色测定方法。在可见光波段，通常采用钨灯作为可见光区的光源，具有较大共轭体系的分子结构的物质(黄酮等物质)在这一波段会出现特定的吸收，吸收的强度能提供有效的信息并以此作为定量分析基础[14]。如Verma等[15]利用分光光度计对染料颜色的脱色率进行了测定，测色效果良好。

皂素的最大吸收波长在210 nm左右，提取的皂素中一般含有色素、黄酮和单宁等显色杂质[16]。然而，在查阅大量资料后发现：这些显色物质根据现有理论并无统一和准确的标准，并不能简单地通过类似黄酮一种单一物质的最大显色波长来论定。而由分光光度计的原理可知，溶液之所以呈现不同颜色，与它对光的选择性吸收有关，即溶液对可见光区的光吸收越强，则该溶液颜色越深，反之越浅，在此理论基础上同时参考相关文献[17]，选取与皂素无交叉影响的可见光波长510 nm作为脱色率计算标准。同时采用了现有研究中480 nm波长作为研究标准[18]进行对比研究。

物质对光的吸收是有选择性的，本实验选用的510和480 nm属于可见光的范畴，脱色前后的皂素溶液在分光光度计上的吸光度会发生变化，从表3可看出，有些实验组(样品1、 2、 7、 8和9)脱色率相差细微，说明分光光度计是一种对溶液颜色十分敏感的颜色检测仪器。当溶液颜色较深时，对光的吸收较大；溶液颜色较浅时，对光的吸收也较小。

分光光度计对茶皂素溶液色泽的评价能够达到精确且量化的程度，受人为因素影响小，这也是Wang等[19]使用分光光度计对水溶液中酸性橙7的脱色定量测定的原因之一，因此，选用此法作为本研究的主要依据。由数据可知，对比510、 480 nm下脱色皂素溶液的测定结果，发现在两个波段的原料皂素吸光度和脱色皂素吸光度均稍有相同，且在510 nm的脱色率均比480 nm高，这可能是由茶皂素中色素和黄酮等显色物质在不同波段的吸光度有差异导致的，但两个波段脱色率呈现一致规律，且最佳条件的脱色率均达到较高水平。由此可见分光光度计适用于对茶皂素溶液进行精确且量化的颜色测定；同时在选用分光光度计作为色泽评价工具时需综合考察显色物质在不同可见光波段对结果的影响。

表3 分光光度计脱色率和罗维朋比色计脱色率

2.2.2罗维朋比色计法 罗维朋比色计是一种目视颜色测量仪器，它采用了国际公认的专用色标——罗维朋色标度来测量各种液体、胶体、固体和粉末样品的色度。如Irshad等[20]使用罗维朋比色计成功地评价了一种固体肉制品的颜色。该仪器具有结构简单，操作便利的特点，常用于食油、饮料、果酱等物质的颜色测定[21-22]。

罗维朋比色计利用一系列的滤色片对白光加以吸收，通过滤色片后的光色与待测颜色进行比较得到结果，是一种结构简单、使用方便的目视测色仪器。可以测定固体和液体等物质的颜色，是国际上普遍采用的测量色度的仪器，该法只需测定红、黄、蓝3个值，且本实验发现不需使用蓝色滤色片。本实验测得的黄度值都是10，故不列出，只测量红度值的大小。

分光光度计适合样品中显色物质在可见光波段有明显吸收时使用，而罗维朋比色计虽然无法达到其精确量化程度，但罗维朋比色不受吸光度需介于0.2～1.0条件的拘束，在需要对物质颜色进行更广泛的测定场景中占有优势。但因为影响罗维朋比色计测量结果准确度的因素较多[23]，例如不同观察者用同一仪器测量同一样品有可能会有不同的测量值，张静雯等[24]和周德祥等[25]研究发现在实验中比色片的颜色会随着使用者的长时间使用而逐渐失真，因此罗维朋比色计只能间歇使用，长时间使用会出现视觉疲劳，出现误差，影响颜色评价准确性。此方法的优点是操作简单，且能够达到定性分析和粗略定量分析程度。

2.2.3分光辐射亮度计法 分光辐射亮度计通过测量物体反射的光谱功率分布或者物体本身的反射光度特性，然后根据光谱测量数据计算出物体在各种标准光源和标准照明体下的三刺激值(L*、a*和b*)。三刺激值系统在颜色科学和纺织物色彩[26]领域中被广泛应用，近年来在其他领域也被逐渐应用。Peterson等[27]就在视觉评价的基础上，运用分光辐射亮度计对小麦籽粒颜色进行了客观的评价，研究也表明L*、a*和b*3个数值难以捕捉到视觉上的“微妙之处”。Schelkopf等[28]利用类似的装置测定成熟牛肉的3个刺激值(L*、a*和b*)，评估了成熟牛肉的胸长肌。分光辐射亮度计是一种对固体颜色评价的仪器，该法将脱色后的皂素进行干燥研磨后再进行测定。测得的3个指标L*、a*和b*能形成一个简化的颜色空间，它在三维色空间的各个方向轴上具有视觉生态学的等距性，而且在明度指数和色品指数有区分，越来越受到各行业的广泛重视和应用[29]。其中，明度值L*是衡量颜色深浅的一个指标(表4)，因此，将L*值用作脱色率计算的评价指标。与分光光度计法相比，最优条件下脱色率依旧达到一个很高的水平，进一步证明了此正交试验得出的最佳条件是可行的。由表4可知，有些试验的脱色率与分光光度计法相比较低，脱色率较低(样品3)的测得的b*值(由1.3.2节可知b*为正值时样品的黄色比蓝色占优势)明显高于其他试验，这有可能是H-K效应[30]导致的，即样品的明度值会随着颜色强度的加深而降低，进而影响测量结果。也就是说分光辐射亮度计作为一种颜色测定的补充办法较为合适，这与陈泠等[31]对小麦颜色测定的结论相一致。与分光光度计相比，分光辐射亮度计不仅可用于茶皂素颜色的定量分析，在此基础上细分了明度与色品的极差，而且可适用于较小色差情况下的颜色测量、比较和讨论。

表4 分光辐射亮度计数据

2.2.4直观观察拍照法 直观观察拍照法可以直观地看出物体颜色的深浅，不同光照条件下物质的颜色会发生变化，所以本研究是在实验室中同一光照环境使用相机对样品进行拍照(图2)。

图2 直观观察拍照法评价油茶皂素颜色结果

由图可以看出，原料的颜色较深，而经脱色后的皂素分别呈现不同程度的脱色效果，经最佳条件脱色后的皂素颜色呈现乳白色，不仅证明了本研究的脱色条件的可行性，同时间接佐证了分光光度计法的精确性和量化性。且在实验中发现，茶皂素保存时间较长时，其颜色有可能会因为氧化等反应而发生改变。为了更方便地对茶皂素颜色进行时间和空间上的记录，相对于普通相机，使用数码相机能够达到更完整和更持久的保存目标。

2.2.5色阶比色法 色阶比色法也是一种较为常用的皂素色泽评价方法[32]。该法通过制备不同浓度的皂素溶液，即色阶比色卡，其溶液颜色随浓度的降低而减淡，利用脱色前和脱色后的溶液与色阶比色卡进行比对，找出最接近的色阶序列号。王超等[33]利用色阶比色法对皂素颜色进行比较，但其仅通过一人试验即得出结果，误差较大。本研究为了减小由于人为感官之间的差异性而导致的误差，通过 3个不同的测试者对脱色皂素试液和原料试液颜色进行比色，色阶比色结果见表5。其中测试样品包含原料、正交试验1～9号及最优条件下的皂素。由表可见，最优条件下的比色结果仍然处于优势地位。

与罗维朋比色法类似，色阶比色法使用时人为因素影响较大，但与其不同的是，色阶比色法不会出现由于长时间眼睛使用产生的视觉疲劳，只需将样品与比色卡进行短暂地比对便能得出结果，操作简便，可行性强。当皂素颜色难以用肉眼区分时，但又亟需一个辨别标准时色阶比色法能起到事半功倍的效果。

表5 色阶比色结果1)

2.3 几种方法结果对比

不同色泽评价方法对两组最优脱色条件下得到的脱色皂素评价结果见表6。

表6 最优条件色泽评价表

由表可见，在最优条件下脱色后的茶皂素，其分光光度计(510 nm)色泽评价结果与分光光度计(480 nm)接近，说明分光光度计法的可视化数据使其准确度更高。罗维朋评价结果相差较大，可能因为是一种目视比色法，导致误差较大。色阶比色法结果相同，这是因为相邻两个色阶差异明显，更易比色，这也证明了最优条件方案的可行性，且经直接观察拍照验证，脱色后的油茶皂素经研磨后呈现乳白色，其脱色效果显著，证明该优化条件可行。虽然几种方法测的脱色率略低于实际生产中白色皂素的脱色率值，有可能是不同皂素前处理过程的不同和脱色率计算方式差异所导致的，但本研究使用的脱色剂仅有过氧化氢和凹凸棒土，在生产应用中具有成本低廉和操作简便的优势。Lin等[34]和Chahbane等[35]研究发现，H2O2可以凭借其强氧化性而用于含有还原性强的活性染料的纺织品废水的脱色，说明茶皂素中的显色物质是具有还原性的，而通过乙醇提取的茶皂素通常含有多糖、蛋白质等还原性强的物质[36]，H2O2会与这些物质发生氧化反应而导致皂素色泽的变浅；凹凸棒土具有吸附茶皂素中色素类物质的作用，色素含量的降低同样会对茶皂素颜色产生影响。本研究结果证明：过氧化氢/凹凸棒土耦合体系适用于油茶皂素这类五环三萜类化合物中杂质的颜色去除，并且脱色效果显著。

3 结 论

3.1 通过水浸提或者醇提的皂素通常含有多酚、多糖和色素等杂质，且色素类物质大多含有共轭双键，本研究利用过氧化氢/凹凸棒土耦合体系对油茶皂素进行脱色，通过正交试验得出最佳脱色条件：H2O2用量6%，温度80 ℃，时间3 h，凹凸棒土用量3%。在此条件下可得到颜色为乳白色的脱色皂素，其脱色率达到(79.52±0.53)%(分光光度计510 nm)和(78.33±0.9)%(分光光度计480 nm)。其他色泽评价结果基本相近。

3.2 运用不同色泽评价方法对油茶皂素脱色效果进行评价，结果表明：分光光度计法精确度高、人为因素影响小，能够达到对茶皂素溶液颜色的定量分析。分光辐射亮度计细分了明度与色品的极差，适用于较小色差情况下的颜色测量、比较和讨论。罗维朋比色计是一种目视比色仪，受人为因素影响较大，但在需要对油茶皂素溶液进行较广泛的色泽分析场景中具有优势。直观拍照法可以直观显现出油茶皂素的颜色深浅，可以作为其他颜色鉴定的直接佐证和依据。色阶比色法不易出现视觉疲劳，可行性强。