蒈烷-3,4-二醇的除草活性

朱茂茂, 黄焰群， 卢平平, 黄道战,2*

(1.广西民族大学 化学化工学院，林产化学与工程国家民委重点实验室，广西 南宁 530008； 2.广西林产化学与工程重点实验室，广西林产化学与工程协同创新中心，广西 南宁 530008；3.广西民族大学 材料与环境学院，广西 南宁 530105)

除草剂在现代农业中发挥着重要的作用，不仅可以有效防控杂草危害，增加农作物产量，改善农产品品质，而且可以减轻劳动强度，提高生产效率。随着人们对饮食安全和生态环境保护意识的增强，研究开发高效低毒的除草剂及其绿色环境友好剂型已成为当前国家政策要求、行业发展共识[1-3]。单萜类化合物是许多植物的次生代谢产物，通常表现良好的生物活性[4-6]，例如对孟烷-3,8-二醇是一种含有两个羟基的单萜类化合物，也可归属为单萜二醇[7-8]，天然存在于柠檬桉树枝叶精油[9-10]，也能够以一些植物精油成分香茅醛、巴豆醛、薄荷醇等为原料通过化学或生物转化制备[11-13]，具有良好的驱蚊、除草等生物活性[9,14]，目前已作为高效低毒的驱蚊剂进行商品化开发应用。然而，对孟烷-3,8-二醇因天然来源不足，香茅醛、巴豆醛、薄荷醇等合成原料又价格昂贵，其推广应用受到了限制。蒈烷-3,4-二醇也是一种单萜二醇，在自然界含量少，但容易合成，其可以以在松节油天然单萜烯类化合物中资源储量丰富、产量仅次于α-蒎烯和β-蒎烯的3-蒈烯[15]为原料，经环氧化、环氧开环水解反应合成[16]。蒈烷-3,4-二醇分子结构含有1 个亲油性蒈烷结构和2个亲水性羟基官能团，具有蚊蝇驱避活性[17-18]，对人畜健康、生态环境友好，且价格明显低于对孟烷-3,8-二醇，极有可能在农药绿色化方面发挥更大作用。但有关蒈烷-3,4-二醇的除草活性及应用研究，国内外鲜有报道。为此，近年来，本课题组采用杂多酸季铵盐/双氧水相转移绿色催化技术改进优化了3,4-环氧蒈烯的制备工艺[19]，在此基础上，开展蒈烷-3,4-二醇及其衍生物的合成、除草活性及应用研究，研究蒈烷-3,4-二醇在水溶液中对黑麦草、油菜的根与茎伸长的抑制作用，以期探讨其作为水基植物源除草剂的应用性能。

1 实 验

1.1 材料与仪器

一年生黑麦草(LoliummultiflorumLam.)和油菜(Brassicacampestris)种子，分别购自百绿(天津)国际草业有限公司和广西万和种业有限公司；3,4-环氧蒈烷，GC纯度98%，参照文献[19]方法由实验室自制；对孟烷-3,8-二醇，GC纯度96%，购自广西中乐大健康产业有限责任公司；草甘膦，纯度97%，由广西田园生化有限责任公司提供；其余试剂均为市售分析纯。

FYX-100型种子发芽箱和LRH-250-GSI型人工气候箱，广东韶关市泰宏医疗器械有限公司；GC-2014C型气相色谱仪，岛津仪器(苏州)有限公司；MAT95型高分辨率气相色谱质谱联用仪，美国Thermo公司；Magna IR-550型傅里叶变换红外吸收光谱仪，美国Nicolet公司；Avance II 600MHz核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；HH-501型超级恒温水浴，常州普天仪器制造有限公司；X-5型显微熔点测定仪，北京世纪科信科学仪器有限公司。

1.2 蒈烷-3,4-二醇的合成

取5 mL蒸馏水，用质量分数20%的稀硫酸调节pH值为2～3左右，加入到装有3,4-环氧蒈烷12 mmol(1.82 g)的50 mL圆底烧瓶中，在室温(30 ℃)下搅拌，水解反应2 h。反应结束，经减压过滤收集不溶性沉淀物得白色固体粗产物。将粗产物以正己烷为溶剂重结晶一次，得无色针状晶体，产率85.6%，经气相色谱分析，GC纯度95%。

1.3 结构鉴定及理化性质测定

1.3.1高分辨率质谱分析 取少量样品，以无水乙醇溶解，将溶液在高分辨率气相色谱质谱联用仪上直接进样分析。气相色谱条件：DB-5型弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，N2为载气，FID检测器；初温60 ℃，保持0.5 min，先以5 ℃/min升至80 ℃，保持0.5 min，再以20 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，最后以4 ℃/min升至280 ℃，保持0.5 min；进样口温度280 ℃，检测器温度280 ℃。质谱条件：电离源，电子轰击；质量范围<3 500 u；分辨率<60 000；最高加热温度360 ℃。

1.3.2红外光谱分析 取少量样品，采用溴化钾压片法对样品进行分析，获取红外吸收光谱，波长扫描范围400～4 000 cm-1。

1.3.3核磁共振波谱分析 称取少量样品，以氘代氯仿为溶剂，四甲基硅烷为内标，测定1H和13C核磁共振图谱。

1.3.4溶解度测定 取适量样品溶解，置于超级恒温水浴中在25 ℃下恒温平衡2 h，配成饱和溶液。用移液管定量移取5 mL饱和溶液放入预先干燥质量恒定的圆底烧瓶中，蒸发除去溶剂，干燥至质量恒定后称量、计算溶解度，溶解度(g/L)=(圆底烧瓶中剩余物质量)×103/5。同法，以不同溶剂进行试验，比较溶剂对溶解度的影响。

1.3.5亲水亲油性 采用计算机软件ChemBiodraw 14.0求算脂水分配系数(cLogP)，讨论化合物的分子结构与溶解性、亲水亲油性的关系。

1.4 除草活性测试

1.4.1溶液配制 样品母液：称取2 mmol供试化合物用0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，转入100 mL的容量瓶，加入5 mL 1%的吐温-80乳化剂，以无菌蒸馏水稀释定容，充分混合配成浓度为20 mmol/L的样品母液。供试样品溶液：先取5 mL N,N-二甲基甲酰胺和50 mL 1%的吐温-80置于1 L的容量瓶中，以无菌蒸馏水定容，混合均匀配成空白溶液，然后，按二倍稀释法将供试样品母液稀释配制成浓度为10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 mmol/L的供试样品溶液。

1.4.2除草活性评价 除草活性采用平皿培养法，考察蒈烷-3,4-二醇对单子叶植物一年生黑麦草和双子叶植物油菜根、茎伸长的抑制作用，并与对孟烷-3,8-二醇和商业除草剂草甘膦相比较，讨论其除草活性。实验操作如下：先将种子浸泡在2%次氯酸钠溶液中消毒5 min，以无菌水冲洗3次，置于无菌水中浸泡处理15 h，然后，置于底部放有两张圆形滤纸的培养皿(直径9 cm)中，加入适量无菌水，置于培养箱中在25 ℃黑暗条件下培养24 h，使种子萌发露白。挑选10粒已萌发露白的种子放入直径9 cm、底部放有两张圆形滤纸培养皿中，均匀分布，将10 mL样品溶液倒入培养皿中，每种浓度的样品溶液和空白液做3组重复实验；将培养皿置于培养箱中，在25 ℃黑暗条件下培养72 h后，测量胚根和茎的长度，按以下公式计算根和茎伸长的抑制率，若根长或茎长小于1 mm时，不予统计、计算。

抑制率=(空白对照组根(茎)长-处理组根(茎)长)/空白对照组根(茎)长×100%

1.4.3数据分析 参照文献[20]方法，采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行线性回归分析处理，求算半数抑制浓度(IC50)和毒力回归方程，讨论蒈烷-3,4-二醇和对孟烷-3,8-二醇的除草活性。

2 结果与讨论

2.1 化合物的结构分析

对1.2节制备的化合物进行分析，其结果如下：高分辨率质谱分析结果显示，化合物具有分子离子峰[M]+，质荷比值为170.130 5，与理论计算值170.130 7基本相符。红外吸收光谱主要特征吸收峰及归属为：3 381和3 217 cm-1，羟基O—H伸缩振动吸收峰；2 997和2 983 cm-1，甲基、亚甲基C—H不对称伸缩振动吸收峰； 2 866 cm-1，甲基、亚甲基C—H对称伸缩振动吸收峰；1 447和1 381 cm-1，分别为甲基、亚甲基C—H的不对称性和对称性面外弯曲振动吸收峰；1 116和1 063 cm-1，C—O伸缩振动吸收峰。

1H核磁共振图谱(600 MHz, CDCl3)质子的化学位移值(δ)及归属如下：3.298～3.328(dd，J=1.8, 2.4 Hz,1H，H- 4)，2.830(s，2H，OH)，2.039～2.076(m，1H，H-5)，1.916～1.956(m，1H，H-2)，1.597～1.651(m，1H，H-5)，1.182～1.176(dd，1H，J=3.6 Hz, H-2)，1.174(s，3H，H-9)，0.958(s，3H，H-10)，0.941(s，3H，H-8)，0.690(ddd，2H，H-1，6)。数据显示，化合物有18个质子，其中与C4相连的质子吸收峰δ在3.298～3.328，呈双二重峰；两个羟基质子δ均为2.830，呈单峰；C8、C9和C10相连的甲基δ分别为1.194、 0.958和0.941，均呈单峰。

13C核磁共振图谱(150 MHz,CDCl3)碳核的化学位移值(δ)及归属如下: 74.20(C4)，73.14(C3)，33.51(C2)，28.45(C5)，27.63(C10)，20.78(C6)，19.75(C9)，18.74(C8)，17.41(C1)，15.56(C7)。这表明，化合物有10个碳原子，其中受羟基吸电子效应的影响，C4和C3的吸收峰在低场，δ分别为74.20和73.14。

上述结构分析结果与文献[16]相符，证明化合物的分子结构为蒈烷-3,4-二醇(分子式C10H18O2)。

2.2 蒈烷-3,4-二醇的理化性质

蒈烷-3,4-二醇的分子结构(下图)含有两个亲水性羟基官能团，常温常压条件下也是一种结晶性固体。单晶X-衍射分析显示，蒈烷-3,4-二醇通常以结晶水合物[21]的形式存在，其分子晶体除了存在蒈烷-3,4-二醇分子内氢键外，还存在蒈烷-3,4-二醇与水分子之间丰富复杂的分子间氢键。对孟烷-3,8-二醇虽然结构与蒈烷-3,4-二醇的相似，但其晶体不含结晶水[22]，其分子晶体仅存在自身分子内氢键和分子间氢键。因此，蒈烷-3,4-二醇和对孟烷-3,8-二醇在熔点、溶解性和亲水亲油性等理化性质有明显的差别。

蒈烷-3,4-二醇的理化性质如表1所示。由表1可见，蒈烷-3,4-二醇、对孟烷-3,8-二醇及草甘膦均微溶于水，在水中的溶解度(为便于比较，蒈烷-3,4-二醇的溶解度测定值仍按不含结晶水计)由小到大的顺序为：对孟烷-3,8-二醇<蒈烷-3,4-二醇<草甘膦。然而，蒈烷-3,4-二醇和对孟烷-3,8-二醇易溶于无水乙醇、乙酸乙酯、二甲亚砜和二甲基甲酰胺等亲水性溶剂。草甘膦在所考察有机溶剂中的溶解度最低，对孟烷-3,8-二醇在正己烷中的溶解度最大。因此，可以参照水基农药制剂的制备方法，先将蒈烷-3,4-二醇和对孟烷-3,8-二醇以亲水性溶剂溶解配制成较高浓度的水基化剂型，在使用时可直接以水稀释。

表1 蒈烷-3,4-二醇的理化性质1)

2.3 蒈烷-3,4-二醇的除草活性评价

2.3.1对黑麦草根、茎伸长的抑制作用 对孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇和草甘膦在不同浓度下对黑麦草的根、茎伸长的抑制率、毒力回归方程以及半数抑制浓度(IC50)分别列于表2和表3。

表2 蒈烷-3,4-二醇在不同浓度下对黑麦草根和茎伸长的抑制率1)

由表2可知，与草甘膦一样，蒈烷-3,4-二醇和对孟烷-3,8-二醇都能抑制黑麦草根、茎的伸长，其抑制作用随着浓度的升高而增强；当对孟烷-3,8-二醇和草甘膦的浓度为0.625 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇的浓度为0.563 mmol/L时，其对根伸长的抑制率分别达到2.8% 、 65.5%和15.1%，而对茎伸长的抑制率分别为-11.9%、 69.1% 和13.0%；当对孟烷-3,8-二醇和草甘膦的浓度从0.625 mmol/L升高至5.00 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇的浓度升高至4.50 mmol/L时，对根伸长的抑制率分别达到92.9%、 100%和100%，而对茎伸长的抑制率分别为72.7%、 100%和85.6%。

表3 蒈烷-3,4-二醇对黑麦草根和茎伸长的毒力回归方程及半数抑制浓度

表3显示，蒈烷-3,4-二醇、对孟烷-3,8-二醇和草甘膦对黑麦草的根长和茎长的毒力回归方程的相关系数(R2)均大于0.8，表明抑制率与浓度密切相关；蒈烷-3,4-二醇、对孟烷-3,8-二醇和草甘膦对根长的半数抑制浓度(IC50)分别为1.12、 1.78和0.51 mmol/L，而对茎长的IC50分别为1.73、 2.55和0.37 mmol/L，表明蒈烷-3,4-二醇对黑麦草的除草活性高于对孟烷-3,8-二醇，低于草甘膦。

2.3.2对油菜根、茎伸长的抑制作用 对孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇和草甘膦在不同浓度下对油菜根长、茎长的抑制率、毒力回归方程以及IC50分别列于表4和表5。由表4可以看出，与草甘膦相似，对孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇也都能抑制油菜根、茎的伸长，其抑制率随着浓度升高而明显增强，当对孟烷-3,8-二醇和草甘膦浓度为0.625 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇浓度为0.562 5 mmol/L时，对根伸长的抑制率分别达到-9.10%、 64.2%和15.7%，而对茎伸长的抑制率分别为-18.7%、 42.1%和5.90%。当对孟烷-3,8-二醇和草甘膦浓度为5.00 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇浓度为4.50 mmol/L，对根伸长的抑制率分别为82.5%、 97.3%和97.2%，而对茎伸长的抑制率分别为61.7%、 83.2%和80.0%。

表4 蒈烷-3,4-二醇在不同浓度下对油菜根和茎伸长的抑制率

表5 蒈烷-3,4-二醇对油菜根长和茎长的毒力回归方程及半数抑制浓度

由表5可知，蒈烷-3,4-二醇、对孟烷-3,8-二醇和草甘膦对油菜根长和茎长的毒力回归方程的R2也均大于0.8，表明抑制率也与浓度密切相关；蒈烷-3,4-二醇、对孟烷-3,8-二醇和草甘膦对根长的IC50分别为1.23、 3.10和0.43 mmol/L，而对茎长的IC50分别为2.12、 2.99和1.14 mmol/L。以上数据表明，蒈烷-3,4-二醇对油菜的除草活性也高于对孟烷-3,8-二醇，低于草甘膦。

3 结 论

以黑麦草和油菜分别作为单子叶、双子叶供试植物，考察蒈烷-3,4-二醇的除草活性。结果表明：蒈烷-3,4-二醇能够抑制黑麦草和油菜根、茎伸长，表现与浓度相关的除草活性；其对黑麦草根、茎伸长的半数抑制浓度(IC50)分别为1.12和1.73 mmol/L, 而其对油菜根、茎长的IC50分别为1.23和2.12 mmol/L。蒈烷-3,4-二醇对黑麦草和油菜的除草活性高于与其结构相似的对孟烷-3,8-二醇而低于商业除草剂草甘膦，并且其在水中的溶解度为4.0 g/L，脂水分配系数为1.604，但其分子结构中含有两个在化学反应活性、空间位阻方面有较大差异的羟基官能团，有望通过选择性衍生化或采用复配技术，协同或增强其除草活性，可应用于植物源水基除草剂的研究开发。