SLC22A12基因多态性与吡嗪酰胺诱导高尿酸血症的易感性研究

彭江丽 陈洁 陈永刚 王璐 李娜 罗季 韩祎 喻明丽 朱江春

目前，结核病仍是全球重大公共卫生问题之一，结核病防控形势依然十分严峻[1-2]。吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是非常有效的一线抗结核药物，也是用于耐药结核病治疗的重要药物，并被推荐与二线抗结核药物全程联合使用[3-4]。然而，高尿酸血症是吡嗪酰胺除肝毒性外最常见的药物不良反应，在其诱发关节炎或急性痛风后可导致抗结核治疗不连续或停药，影响治疗效果[5-6]。有研究显示，吡嗪酰胺的活性代谢物吡嗪酸可刺激人尿酸盐转运蛋白(human urate transporter，hURAT)的活性，大幅增加肾小管近曲小管对尿酸盐的重吸收，破坏机体尿酸盐的动态平衡，进而诱导高尿酸血症[7-8]。hURAT是体内血尿酸水平调节的关键蛋白，是由溶质载体家族22成员12(solute carrier family 22 member 12，SLC22A12)基因编码[9-10]。作为高尿酸血症的重要候选基因，SLC22A12基因多态性所导致的hURATl产物的改变和(或)活性的改变，可能是不同个体之间高尿酸血症易感性不同的重要原因。目前尚不明确SLC22A12基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是否与肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症的发生风险密切相关。因此，笔者对二者相关性进行探讨，为临床治疗提供参考。

对象和方法

一、研究对象

从2019年1月至2021年3月昆明市第三人民医院结核科住院治疗的12 000例肺结核患者中筛选出约6500例强化期含吡嗪酰胺抗结核方案的患者作为初步研究对象，参照排除标准中(1)～(5)条，筛选可入组的4800例研究对象并开始按要求服用吡嗪酰胺；服用吡嗪酰胺期间定期监测血清尿酸等生化指标，观察血清尿酸变化情况(每2～3天复查1次)，期间符合排除标准中(6)～(8)任一条剔除；吡嗪酰胺服用4～5周时，根据诱导高尿酸血症情况及高尿酸血症判定标准，将研究对象分为尿酸升高组和尿酸正常组，判定入组时，分别采集两组研究对象外周静脉血5 ml，存于-80 ℃冰箱备用后续全血DNA提取；最终纳入尿酸升高组294例，其中，男性155例(52.72%)、女性139例(47.28%)，平均年龄为(46.80±9.98)岁；纳入尿酸正常组220例，其中，男性118例(53.64%)、女性102例(46.36%)，平均年龄为(45.91±10.76)岁；两组患者在性别分布和年龄的差异均无统计学意义(χ2=0.042，P=0.837；t=0.065，P=0.573)。本研究通过昆明市第三人民医院伦理委员会审批(批号：2019031992)，患者均经知情同意并签署知情同意书。

纳入标准：(1)研究对象来自中国云南地区的汉族人群，个体间无血缘关系，年龄范围为18～75岁，且尿酸升高组和尿酸正常组在某个年龄段及性别的比例均尽可能按照1∶1进行匹配，一般控制在1∶4以内；(2)肺结核诊断参照《WS 288—2017肺结核诊断》；(3)强化期抗结核治疗方案包含有吡嗪酰胺(口服，0.5 g/次，3次/d)，住院治疗观察周期为吡嗪酰胺治疗4～5周；(4)服用吡嗪酰胺前血清尿酸及肾功能均正常。

排除标准：(1)服用吡嗪酰胺前已合并原发性高尿酸血症及痛风者；(2)家族史具有高尿酸血症及痛风者；(3)服用吡嗪酰胺前已存在不明原因尿酸增高者；(4)服用吡嗪酰胺前肾功能异常者；(5)同时合并血液系统疾病、肿瘤、肾脏疾病、肝脏疾病、银屑病等可能导致继发性高尿酸血症者；(6)服用吡嗪酰胺期间同时使用乙胺丁醇、阿司匹林、噻嗪类利尿药、免疫抑制剂(环孢素、他克莫司)等常见的导致血尿酸升高药物者；(7)服用吡嗪酰胺过程中未限制动物内脏、海鲜、啤酒等高嘌呤饮食摄入者；(8)病历资料不完整者。研究对象筛选流程见图1。

图1 研究对象筛选流程

二、研究方法

1.生化指标测定：为维持吡嗪酰胺连续使用确保抗结核疗效，本研究结合临床实际情况，在吡嗪酰胺使用前及使用后每2～3 d复查1次，监测周期为4～5周[11-12]。采用红色分离胶生化管采集各监测时间点研究对象外周静脉血4 ml，应用全自动生化分析仪测定研究对象血清尿酸、尿素氮和肌酐。检验员经过统一培训，使用统一标准试剂、质控标本。本研究根据吡嗪酰胺服用第4～5周诱导高尿酸血症的情况，以非同日2次血尿酸水平男性>416 μmol/L、女性>357 μmol/L判定为高尿酸血症。

2.全血DNA提取：所有患者分组后，采用紫色EDTA抗凝管采集外周静脉血5 ml，存于-80 ℃冰箱备用后续全血DNA提取。采用基因组DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取全血DNA，使用 NanoDrop 2000仪器进行吸光度(A)值检测，选取所测A值为1.6～2.2的样本进行1.25%琼脂糖凝胶电泳检测。当质检评估符合Massarray SNP分型DNA质量要求后，转移至96孔板，-20 ℃储存备用。

3.SLC22A12基因各位点分型检测：采用MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪(美国Agena Bioscience公司)进行SNP Sequenom MassARRAY分型检测。首先通过PCR扩增包含SNP位点的DNA序列，再通过UEP单碱基延伸引物扩增上述PCR产物，该延伸引物只扩增与待检测SNP位点互补的碱基即终止，最终延伸产物通过飞行时间质谱系统(time of flight，TOF)进行分析，根据不同碱基的分子量差异对SNP进行分型。本研究SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688、rs476037位点是以国际人类基因组计划数据库Hapmap最小等位基因频率(MAF)>0.05，r2>0.8，并优选错义、同义、启动子、非 UTR 区等功能SNP为原则，从NCBI的SNP数据库挑选出来，并同时查阅大量文献进行最终选择。多重SNP位点引物设计采用Assay Designer 4.0软件进行设计评估，并根据不同的位点信息酌情调整设计参数，满足最优化标准。采用PAGE引物纯化方法，合成每个SNP位点对应的3条引物，分别为2条PCR引物和1条UEP单碱基延伸引物，引物序列见表1。以上基因分型检测委托博淼生物(北京)科技有限公司完成。基因型频率为基因型个体数/个体总数，而等位基因频率是个体总数的2倍，1个等位基因的频率为该等位基因纯合子的频率+1/2杂合子的频率，即：等位基因频率=(2倍该基因型纯合子个体数+杂合子的频率个体数)/2倍个体总数。

表1 SLC22A12基因多重SNP位点引物设计

三、统计学处理

结 果

一、两组临床资料比较

吡嗪酰胺使用前，两组患者尿酸、血尿素氮、血肌酐均正常，且差异均无统计学意义(P值均>0.05)。吡嗪酰胺使用4周时，两组患者血肌酐、血尿素氮均未发生明显改变，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，但尿酸升高组血尿酸明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。具体见表2。

表2 两组患者服用吡嗪酰胺前后血清尿酸、血尿素氮和血肌酐水平比较

二、SLC22A12基因SNP分型检测结果

SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688和rs476037位点SNP Sequenom MassARRAY分型检测结果显示，rs11602903位点基因分型为：AA纯合野生、TA杂合突变型和TT纯合突变型；rs559946和rs475688位点基因分型均为：CC纯合野生型、TC杂合突变型和TT纯合突变型；rs476037位点基因分型为：GG纯合野生型、AG杂合突变型、AA纯合突变型。

三、Hardy-Weinberg遗传平衡检验

尿酸升高组与尿酸正常组的SLC22A12基因的4个位点(rs11602903、rs559946、rs475688和rs476037)基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P值均>0.05)，具体见表3。

表3 两组患者SLC22A12基因各位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验情况

四、两组基因型频率及等位基因频率比较(表4，5)

表4 两组患者基因型及等位基因分布比较 [频次(频率，%)]

尿酸升高组rs11602903位点的AA基因型频率和A等位基因频率均高于尿酸正常组，而TA和TT基因型频率均低于尿酸正常组，两组间分布差异均有统计学意义。经校正性别和年龄因素后，logistic 回归分析显示，携带TA和TT基因型及T等位基因均是降低肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症风险的因素(OR值分别为0.425、0.328、0.511)。

尿酸升高组rs559946位点的CC和TT基因型和C等位基因频率均高于尿酸正常组，而TC基因型频率低于尿酸正常组，两组间分布差异均有统计学意义。logistic回归分析结果显示：携带TC基因型及T等位基因均是降低肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症风险的因素(OR值分别为0.578和0.716)。

表5 肺结核患者SLC22A12基因多态性对吡嗪酰胺诱导高尿酸血症影响的多因素logistic回归分析

尿酸升高组rs475688位点的各基因型频率及等位基因频率分布与正常组相比，差异均有统计学意义。logistic回归分析结果显示，TC、TT基因型及携带T等位基因肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症的风险分别是参照组的2.028倍、6.077倍及2.229倍。

尿酸升高组rs476037位点各基因型及等位基因频率分布与正常组相比，差异均无统计学意义。

讨 论

吡嗪酰胺导致的高尿酸血症国内报告临床发生率高达70%以上[11]，一般在吡嗪酰胺使用1～2周逐渐出现，第4～5周达到高峰，大多数患者的血清尿酸水平都在正常高限的2倍左右，少数患者血清尿酸可能会进行性升高。以往普遍认为，高尿酸血症是一个短暂的过程，且停药后即可恢复，也不会对疾病的预后及患者自身产生影响，临床也不需要更改方案，认为吡嗪酰胺的监测意义不大。然而，在临床实际工作中，虽然停用吡嗪酰胺后，患者血清尿酸水平开始下降，但大多数患者的血清尿酸水平在短时间内并不能恢复到正常水平，一般需在停药后的1～2个月后才能恢复正常，也有病例报告发现少数患者在停药2年以后血清尿酸水平仍维持在0.1 g/L，在体内可形成多个痛风石[11-13]，对心、肾、血管等组织器官具有直接致病作用[13]。这些均提示高尿酸血症仍然会引起患者严重不良结局，其临床危害不容忽视。而且临床为了确保抗结核治疗效果，一般不会随意停用吡嗪酰胺，当血清尿酸超过正常参考值高限后若进行性升高，会及时给予碳酸氢钠、别嘌醇等降尿酸对症治疗，并对患者尿酸变化情况严密监测，以保证患者用药安全。因此，随着吡嗪酰胺在耐药结核病的广泛及长疗程使用，高尿酸血症对抗结核方案的制定及执行的影响愈发明显，尤其是对于合并糖尿病、肾病、高龄等进行抗结核治疗的特殊人群，更应该引起关注。

hURAT是近年研究发现位于肾小管上皮细胞最重要的尿酸重吸收转运体，与其他转运体相比，hURAT对尿酸盐具有较强的底物特异性。hURAT 位于染色体11q13上，含有9个内含子和10个外显子，cDNA全长2642 bp，是一个完整的跨膜蛋白[14-15]。本研究所选SLC22A12基因rs11602903和rs559946为功能区域SNP位点，侧重功能调控；rs475688和rs476037为标签SNP位点，是基于CHB数据库进行的强关联代表SNP位点。目前，SLC22A12基因以上位点多态性与高尿酸血症、痛风的相关性报道较多[16-20]，但与肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症的相关性还未见相关报道。

本研究结果发现，尿酸升高组SLC22A12基因rs11602903、rs559946和rs475688位点各基因型频率及等位基因频率分布均与尿酸正常组差异有统计学意义。经校正性别、年龄因素后的logistic回归分析发现，携带rs11602903位点的TA、TT基因型及T等位基因与携带rs559946位点的TC基因型及T等位基因均可能是肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症的保护因素，而携带rs475688位点的TC、TT基因型及T等位基因均可能会明显增加肺结核患者服用吡嗪酰胺后导致高尿酸血症的发生风险。Cho等[16]研究发现，与尿酸正常组相比，尿酸升高组rs11602903位点的AA型纯合子或AT型杂合子受试者患高尿酸血症的风险降低，但发生高尿酸血症的易感基因型与本文结果不一致，可能与该研究样本量有限，以及不同地域、不同种族人群基因多态性分布差异有关。Li等[17]对rs559946多态性与中国汉族男性人群原发性高尿酸血症相关性的研究发现，rs559946多态性与高尿酸血症易感性明显相关，而携带T等位基因能降低患高尿酸血症的风险，这与本文发现一致，提示携带rs559946位点T等位基因可能降低肺结核患者服用吡嗪酰胺诱导高尿酸血症的风险。张小珍[18]发现rs559946 T→C位点的基因型频率和等位基因频率在痛风组和对照组间的差异无统计学意义，提示rs559946 T→C位点与痛风易感无关，这与本文研究结果不一致，可能原因有待进一步探索。国外一项关于SLC22A12基因与痛风易感性之间的Meta分析结果显示，rs475688多态性与痛风易感性存在明显相关[19]；Tu等[20]在一项病例对照研究中发现，SLC22A12基因rs475688与无症状性高尿酸血症和痛风发生有关，携带C等位基因可能增加无症状性高尿酸血症和痛风的发生风险，这也与本文不一致，认为研究的样本量、基因分型方法，以及不同地域和种族等可能与之有关。本研究还发现rs476037位点的各基因型频率及等位基因频率分布在两组间差异均无统计学意义，提示rs476037位点多态性与肺结核患者服用吡嗪酰胺诱导高尿酸血症的发生风险可能无关，而rs476037位点与高尿酸血症的相关性既往并未见相关报道。

精准化治疗是结核病化疗的发展方向，本研究首次通过病例对照研究从基因多态性的角度解释吡嗪酰胺诱导高尿酸血症存在个体差异的原因，该结果的发现可为临床根据不同基因型提前预测吡嗪酰胺诱导高尿酸血症的发病风险、提前制定有效的防治策略、最大限度地减少或避免高尿酸血症的发生提供科学依据

综上所述，SLC22A12基因rs11602903、rs559946、rs475688位点多态性可能与肺结核患者服用吡嗪酰胺导致高尿酸血症的发生风险相关。但本研究样本量有限，所选研究对象仅局限在本院住院治疗的肺结核患者，且仅涉及SLC22A12基因4个多态性位点，必要时可纳入更多功能性位点，并在不同地区和不同民族间开展大样本人群研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献彭江丽和陈洁：实施研究、数据整理及统计分析、撰写及修改文章；陈永刚、王璐、李娜、罗季和韩祎：收集临床资料、整理部分数据、查阅文献；喻明丽和朱江春：筛选研究对象、收集及送检血液标本、整理部分数据、查阅文献、文章修改