四种方法联合检测对病原学阴性肺结核的诊断价值

田丽丽 陈双双 樊瑞芳 张洁 王嫩寒 陈昊 代小伟 任怡宣 赵琰枫 李传友 丁北川 李波 于兰 易俊莉 王佩 杨新宇 宋卫萍

肺结核是一种以呼吸道传播为主要途径的慢性传染病，对患者的生命健康造成严重危害，我国结核病新发患者居全球第3位，仅次于印度和印度尼西亚[1]。WHO发布的《全球结核病报告(2022年)》[1]中显示，2021年全球结核病患者平均病原学(包括细菌学和分子生物学)检测阳性率为63%，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心数据显示，我国2021年结核病患者的病原学(细菌学和分子生物学)检测阳性率为58%，比2020年的55%有所提升[2]；也有报道显示菌阴肺结核患者比例显著增加给我国结核病防治工作带来巨大挑战[3]。病原学阴性肺结核缺少细菌学的相关证据，容易出现误诊和漏诊的现象[4]。随着检查技术的不断发展，多种诊断技术的发明和使用可以减少此现象[5]。免疫学检测技术如结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和结核抗体(TB-Ab)已应用于结核病辅助诊断，尤其在病原学阴性的肺结核患者中意义更大[6-7]。近些年，血红细胞沉降率(ESR)也被应用于辅助诊断结核病[8]。亦有些学者报道[9-10]，结核病患者超敏C-反应蛋白(hs-CRP)升高，亦可用于结核病的辅助诊断。本研究通过探讨T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、hs-CRP 多指标联合检测在病原学阴性肺结核诊断中的价值，为完善和改进临床病原学阴性肺结核的诊断提供一些思路。

资料和方法

一、一般资料

收集2020年7月至2022年7月北京市疾病预防控制中心结核病门诊收治的初治且病原学阴性的肺结核患者216例，以及同期收治的147例病原学阳性的初治肺结核患者和455例其他肺部疾病患者。其中男439例(53.7%)，女379例(46.3%)。患者年龄18～85岁，中位年龄40(29,60)岁。根据《WS 288—2017肺结核诊断》[11]和《WS 196—2017结核病分类》[12]标准，临床诊断病原学阴性肺结核216例(病原学阴性肺结核组)，包括男131例(60.6%)，女85例(39.4%)，年龄中位数(四分位数)为37(25，58)岁；病原学阳性肺结核147例(病原学阳性肺结核组)，男102例(69.4%)，女45例(30.6%)，年龄中位数(四分位数)为42(28，62)岁。依据文献[13]确诊其他肺部疾病455例(其他肺部疾病组) (上呼吸道感染424例、肺炎14例、肺癌1例、支气管炎14例)，男210例(46.2%)，女245例(53.8%)，年龄中位数(四分位数)为42(30，61)岁。本研究经北京市疾病预防控制中心伦理委员会审核(2022-08)。

二、方法

1.T-SPOT.TB检测：采用结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(TS-SPOT.TB试剂盒)，购自北京同生时代生物技术有限公司。从全血样本中分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每个预包被抗γ-干扰素抗体的孔中加入2.5×105个PBMC，分别与早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)、培养滤液蛋白10(CFP10)和Rv3615c共同孵育18～20 h，使用读板仪对斑点进行计数。结果判读标准：(1)阴性对照孔斑点数≤10，超过10个视为无效检测样本；(2)阳性对照孔斑点数应当≥20个或布满整个孔底，如果斑点数<20个时，且通过检测孔与阴性对照孔判定结果为阳性，则视为阳性结果，否则为无效样本； (3)当阳性对照孔斑点数≥20个时，T-N等于5、6、7时，此结果认为是灰区，应当结合其他临床诊断信息进行判断，必要时重复实验。

2.TB-Ab检测：结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)(MP Diagnostics ASSURE®TB Rapid Test)购自MP生物医学亚太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25 μl至检测孔内，加3滴缓冲液于椭圆孔，直至样本前沿到达蓝色指示线即刻拉下分离片，加1滴缓冲液于加样孔，水平放置，15 min内判读结果。结果判读标准：(1)如果在测试线处(T)和质控线处(C)出现紫红色条带，则结核分枝杆菌抗体为阳性，任何深度条带均应判作阳性；(2)如果视窗内仅质控线处(C)显示紫红色条带，则结核分枝杆菌抗体阴性；(3)如果质控线处(C)条带未显示，则结果无效。

3.ESR测定：采用非可替(VACUETTE)全自动ESR检测系统，采集患者外周静脉血2 ml，注入含有3.8% 枸橼酸钠0.4 ml抗凝魏氏ESR采血管内充分混匀，并直立于ESR架上30 min，沉降管应垂直竖立，不能倾斜，观察红细胞下降的速度(mm/1 h)。ESR正常参考值男性0～15 mm/1 h, 女性0～20 mm/1 h。大于参考值上线为阳性。

4.外周血CRP测定:应用日立全自动生化分析仪 (型号:HITACHI7100),试剂购自北京万泰德瑞诊断技术有限公司。严格按照仪器、试剂盒相关说明操作。采用速率散射比浊法检测，检测前经离心10 min分离血清(离心力2600×g),正常hs-CRP浓度0～5.0 mg/L，>5.0 mg/L均为阳性。

三、病原学阴性肺结核诊断流程

病原学阴性肺结核诊断是依据《WS 288—2017肺结核诊断》[11]和 《WS 196—2017结核病分类》[12]标准，专门针对病原学检测阴性肺结核诊断制定的标准。本研究确诊病原学阴性肺结核患者216例，通过门诊部医师详细问诊；实验室检查对每一例就诊的疑似结核病患者进行3次涂片、2次培养、1次分子生物学检测均为阴性，规范利用结核病免疫学辅助检查，如T-SPOT.TB检测和TB-Ab检测，结合胸部影像学检查如胸部X线摄片或CT检查，门诊部肺结核诊断小组多名资深医生共同阅片，鉴别诊断(根据患者的临床表现、胸部影像学特征、免疫学检查结果，以及诊断性抗结核治疗效果进行综合判断)后做出明确诊断。

四、质量控制

T-SPOT.TB检测质量控制：每例患者进行T-SPOT.TB检测的同时做试剂盒内提供的阳性和阴性对照，确保实验结果的准确性；TB-Ab检测质量控制：根据检测反应板质控线条带显示判断，严格按照试剂盒检测规程以保证检测准确性；ESR仪器每年行校准维护；每批次hs-CRP检测行室内质控，并参与北京市临床检验中心室间质评，考核合格。

五、统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计数资料采用“例数，率(%)”描述，组间差异的比较采用卡方检验。 通过Kolmogorov-Smirnov方法检验数据是否呈正态分布，非正态分布的数据以“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”描述。采用诊断性试验比较T-SPOT.TB检测与其他方法对病原学阴性肺结核的诊断价值，绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、3组患者应用不同检测方法阳性率比较

病原学阴性肺结核组、病原学阳性肺结核组、其他肺部疾病组3组患者T-SPOT.TB检测阳性率分别为82.4%、87.8%、28.6%，阳性率差异有统计学意义(χ2=255.492，P=0.000)； 3组患者TB-Ab检测阳性率分别为39.8%、55.8%、18.9%，阳性率差异有统计学意义(χ2=70.049，P=0.000)； 3组患者ESR检测阳性率分别为22.7%、42.2%、7.5%，阳性率差异有统计学意义(χ2=96.703，P=0.000)； 3组患者CRP检测阳性率分别为13.0%、36.73%、5.3%，阳性率差异有统计学意义(χ2=97.492，P=0.000)(表1)。与其他肺部疾病组相比较，四种检测方法在病原学阴性肺结核组阳性率差异均有统计学意义(χ2值分别为170.953、 33.606、 31.271、 12.110，P值均<0.001)，在病原学阳性肺结核组阳性率差异均有统计学意义(χ2值分别为158.758、75.117、99.832、97.503，P值均<0.001)；与病原学阳性肺结核组相比较，TB-Ab、ESR、CRP 三种检测方法在病原学阴性肺结核组阳性率差异均有统计学意义(χ2=8.970，P=0.003；χ2=15.655，P<0.001；χ2=28.267，P<0.001)，而T-SPOT.TB在病原学阴性肺结核组阳性率差异无统计学意义(χ2=1.917，P=0.166)。

表1 三组患者四种方法检测阳性率比较

二、四种检测方法对病原学阴性肺结核的检测效能

以临床诊断为标准，T-SPOT.TB对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为82.4%、71.4%、57.8%、89.5%、75.0%，TB-Ab对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为39.8%、81.1%、50.0%、74.1%、73.9%，ESR对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为22.7%、92.5%、59.0%、71.6%、70.0%，hs-CRP对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为13.0%、94.7%、53.9%、69.6%、68.4%。与其他三种方法比较，T-SPOT.TB对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、阴性预测值和准确度较高，ESR和hs-CRP对病原学阴性肺结核诊断的特异度较高。四种方法联合诊断的敏感度和阴性预测值最高(表2)。

表2 以临床诊断为标准四种检测方法对病原学阴性肺结核的检测效能

三、T-SPOT.TB联合其他3种方法对病原学阴性肺结核的检测阳性率情况

含T-SPOT.TB的两种检测(TB-Ab+T-SPOT.TB、ESR+T-SPOT.TB、hs-CRP+T-SPOT.TB)对病原学阴性肺结核的阳性率分别为89.8%、84.7%、83.3%，与不含T-SPOT.TB的单一检测(TB-Ab/ESR/hs-CRP)的阳性率相比较差异有统计学意义(P<0.05)；含T-SPOT.TB的三种检测(TB-Ab+ESR+T-SPOT.TB/TB-Ab+CRP+T-SPOT.TB/ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)对病原学阴性肺结核阳性率分别为90.7%、90.7%、85.7%，与不含T-SPOT.TB的两种检测(TB-Ab+ESR+/TB-Ab+CRP/ESR+hs-CRP)的阳性率相比较差异有统计学意义(P<0.05)；含T-SPOT.TB的4种检测(TB-Ab+ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)对病原学阴性肺结核的阳性检出率为91.7%，与不含T-SPOT.TB的3种检测(TB-Ab+ESR+hs-CRP)的阳性率相比较差异有统计学意义(P<0.05)。病原学阴性肺结核的阳性率随联合种类增加而递增，联合检测阳性率较单一检测增加， T-SPOT.TB联合TB-Ab检测尤为明显。有T-SPOT.TB参与时其2种、3种、4种方法联合检测的阳性率均明显高于无T-SPOT.TB组(P<0.05)(表3)。

四、联合诊断对病原学阴性肺结核的诊断效能

4种检测方法分别检测及联合检测的ROC曲线见图1，其中T-SPOT.TB的AUC为0.764，标准误差为0.020(95%CI： 0.726～0.802)，大于其他3种方法的AUC(TB-Ab的AUC为0.600，标准误差为0.024(95%CI： 0.553～0.647)；ESR的AUC为0.529，标准误差为0.024(95%CI： 0.482～0.576)；hs-CRP的AUC为0.515，标准误差为0.024(95%CI： 0.468～0.562)，可见T-SPOT.TB对病原学阴性肺结核的诊断相对于其他方法有较高准确性。4种方法联合检测的AUC为0.804，标准误差为0.018(95%CI： 0.769～0.839)，可见联合检测对病原学阴性肺结核的诊断效能更好(图1)。

图1 四种方法联合检测病原学阴性肺结核ROC曲线

讨 论

肺结核是对人类健康造成严重威胁的一种慢性呼吸道传染性疾病，结核病在世界的年发病率逐渐增高[14]。结核分枝杆菌细菌学、分子生物学和病理学检查阳性是肺结核的确诊依据[11-12]。2022年WHO报告[1]估计，2021年全球肺结核患者中37%缺乏病原学诊断依据，比2020年的41%有所降低。我国2021年报告的结核病患者中缺乏病原学确诊依据的占42%，比2020年的45%有所降低[2]。因此，完善病原学阴性肺结核的诊断对肺结核病情的控制有着积极的意义。目前，诊断病原学阴性肺结核除依据胸部影像学检查和临床表现外,实验室的检测指标对诊断可发挥良好作用，T-SPOT.TB和TB-Ab免疫检测方法为辅助诊断病原学阴性肺结核的重要依据[6-7]。本研究探讨以上免疫检测以及ESR和hs-CRP检测诊断病原学阴性肺结核的敏感度、特异度，以及几种方法联合检测病原学阴性肺结核的诊断效能。

T-SPOT.TB是近些年发展起来的快速诊断结核病新技术，其ESAT-6和CFP-10为结核分枝杆菌特有的片段，因此能较好地排除卡介苗接种、非结核分枝杆菌感染[15]。有研究报道，T-SPOT.TB检测肺结核具有更高的敏感度、特异度、准确度[16-17]。本研究中，病原学阴性肺结核组中T-SPOT.TB检测方法的敏感度、阴性预测值和准确度较高，尤其是敏感度明显高于其他三种检测方法，T-SPOT.TB的阳性检出率明显高于其他肺部疾病组，与其他研究结论一致[18-19]； T-SPOT.TB在病原学阴性肺结核组与病原学阳性肺结核组中阳性检出率差异无统计学意义。在病原学阴性肺结核组中，含T-SPOT.TB的四种方法(TB-Ab+ESR+hs-CRP+T-SPOT.TB)联合检测阳性检出率高达91.7%，不含T-SPOT.TB的三种方法(TB-Ab+ESR+hs-CRP)联合检测阳性检出率仅为50.00%，说明T-SPOT.TB检测方法对病原学阴性肺结核的诊断尤为重要。

研究表明，TB-Ab检测对结核病辅助诊断，尤其是病原学阴性患者的辅助诊断有很大价值[7,20]。当然血清TB-Ab检测结果会受到交叉抗原、既往结核分枝杆菌感染史、产品质量、技术及评价体系等因素的影响，故多建议联合其他诊断方式，尽量排除人为因素以达到减少假阳性的目的[21]。本文TB-Ab敏感度、特异度较国内、外一些研究偏低[22-24]，可能主要是因为在试剂中抗原的选择及优化上有区别。敏感度、特异度与杨珊明和周建芳[25]研究相差不大。本研究显示，TB-Ab对病原学阴性肺结核诊断的敏感度高于其他肺部疾病，但低于对病原学阳性肺结核诊断的敏感度，与一些研究一致[18，26]。

ESR指红细胞在一定条件下降的速度，健康人ESR数值会在一个较窄的范围内波动，如若发生恶性组织坏死、炎症、组织损伤等会使ESR加快，因此，ESR在判断肺结核的活动性与非活动性有一定帮助[8]。ESR对组织炎症、损伤及坏死均有影响，对于结核病诊断特异度不高，因此，需要与其他诊断方法联合加以鉴别来提高诊断效能。本研究显示，病原学阴性肺结核组ESR阳性检出率高于其他肺部疾病组，低于病原学阳性肺结核组，均低于马龙凤[27]的报道。

hs-CRP属于y球蛋白，是一种炎症标志物，属于血清中常见的非抗体性蛋白质。近年来,有学者指出血清hs-CRP作为重要的血液生化指标,在结核病合并肺部细菌感染中的筛查、评估效果较好,在肺结核合并肺部细菌感染患者中敏感度(63.45%)较高，高于单纯肺结核患者[9]。因此，此指标对于单纯结核病诊断的特异度并不高，适合同时合并炎症的患者的辅助诊断，需根据患者临床特点与其他检测指标联合诊断。本研究结果显示，病原学阴性肺结核组hs-CRP阳性检出率低于病原学阳性肺结核组，高于其他肺部疾病组，均低于朱捷等[10]的报道。

病原学阴性肺结核由于缺乏细菌学检查证据，仅依靠病史、症状、胸部影像学等综合分析易出现漏诊及误诊。随着细胞免疫学和体液免疫学等更多检测方法的建立和发展，多项方法联合检测对病原学阴性肺结核的早期诊断及鉴别诊断有很大的提高。每种检测方法均有优势与不足，可根据患者临床指征选择联合检测较单项检测更能提高病原学阴性肺结核的检出率，因此，对病原学阴性肺结核采取多种方法联合检测可提升阳性检出率，提高诊断效能，在判别病原学阴性肺结核和排除结核有一定的临床使用价值[18，28]。本研究显示，T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、hs-CRP等四种检测方法均对病原学阴性肺结核有一定诊断价值，尤其是T-SPOT.TB对病原学阴性肺结核的诊断效能优于其他三种方法，但比较与四种方法联合检测，其阳性检出率低于后者。当然，T-SPOT.TB检测也有一定局限性，不能区分活动性肺结核与结核分枝杆菌潜伏感染。有研究报道，肺癌患者T-SPOT.TB阳性率较高，可能因为肿瘤患者免疫力低下，易并发结核分枝杆菌潜伏感染等[29]。此外，我国为结核感染高发国家，这些原因均可能导致T-SPOT.TB特异度较低[6]。本研究中，4种方法联合检测诊断效能较高，尤其是诊断敏感度较高，但特异度比较低，可能与本文联合检测阳性定义(只要有一种方法检测为阳性即定义为联合检测阳性)有关，因此，在提高了诊断的敏感度同时降低了其特异度；AUC为0.804，略低于笔者曾研究4种方法联合检测诊断活动性肺结核AUC，可能与本文仅分析对病原学阴性肺结核的诊断价值，且TB-Ab、ESR、hs-CRP等3种方法在病原学阴性肺结核组阳性检出率低于病原学阳性肺结核组，因此，AUC略低于笔者之前的研究结果[6]。

综上所述,T-SPOT.TB联合TB-Ab、ESR、hs-CRP检测在病原学阴性肺结核诊断中可起到互补作用，实现诊断效能的最大化，结合临床指征对提高病原学阴性肺结核早诊断、早治疗有很重要的临床意义。每种检测方法均有一定不足之处，因此，可根据患者临床指征以及医疗机构实际情况选择不同相关诊断方法联合检测。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献田丽丽：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；陈双双：酝酿和设计实验、采集数据、批判性审阅文章；樊瑞芳、张洁、王嫩寒、陈昊、代小伟、任怡宣、赵琰枫、李波、于兰和易俊莉：采集数据、批判性审阅文章与支持性贡献；李传友和丁北川：分析/解释数据、批判性审阅文章、指导和支持性贡献；杨新宇：采集数据、分析/解释数据、批判性审阅文章、统计分析、指导与支持贡献；王佩和宋卫萍：行政、材料支持、指导和支持性贡献