耐多药肺结核家庭内传播情况分析

周燕 周萌 彭军 段琼红 陈军 周美兰 张云侠 梁军

2021年我国肺结核发病率位居全球第三，为耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)患者数最多的7个国家之一，这7个国家的耐多药/耐药结核病患者数占全球的2/3[1]。MDR-TB治疗需药物种类多、周期长、费用昂贵，已成为我国持续危害人群健康的重大公共卫生问题，阐明其人群传播机制对于MDR-TB的防治至关重要。接触者调查是结核病防控的一项重要措施，家庭接触是密切接触中很重要的一种接触方式。国外文献报道，MDR-TB患者的家庭密切接触者传播MDR-TB的风险较高[2]，但国内关于MDR-TB患者家庭密切接触者传播的相关报道较少，武汉市也缺乏MDR-TB在家庭内传播特征的研究，故笔者对武汉市肺结核定点医院登记的耐多药肺结核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis， MDR-PTB)患者的家庭密切接触者进行感染、发病和菌株同源性的检测，分析MDR-PTB家庭传播模式，为武汉MDR-PTB精准防控提供依据。

对象和方法

一、研究对象

选取2018年7月至2020年6月武汉市肺科医院(武汉市肺结核定点医院)登记的全部166例MDR-PTB患者的282名家庭密切接触者作为研究对象。其中，166例MDR-PTB患者作为本研究中一代病例，282名家庭密切接触者中发现的MDR-PTB患者作为二代病例。

二、研究方法

1.密切接触者：指在一代病例确诊前3个月内与其居住在同一住宅累计至少7 d的人员，既包括共同使用同一卧室者，也包括仅使用共同的起居室而未使用同一卧室者[3]。

2.二代病例发现方式：MDR-PTB患者诊疗信息由专人录入到中国疾病预防控制中心“结核病管理信息系统”。武汉市肺科医院专门设置耐多药结核病门诊，一医一护专职负责建立MDR-PTB患者病案信息。一代病例确诊后的1周内对家庭密切接触者进行1次面对面的症状问诊(即在MDR-PTB患者治疗随访的2年中，家庭密切接触者有无咳嗽、咳痰及发热、盗汗等症状)、结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)、胸部X线摄片(简称“胸片”)检查，对有咳嗽咳痰症状或TST强阳性或胸片异常者收集痰标本，行痰结核分枝杆菌细菌学检测(包含抗酸杆菌痰涂片、分枝杆菌培养+菌种鉴定+表型药物敏感性试验)，以发现家庭二代MDR-PTB 病例。其中，TST试验硬结平均直径<5 mm或无反应者为阴性，≥5 mm为阳性，≥10 mm即可确定为结核感染；阳性又分为一般阳性(5 mm≤硬结平均直径<10 mm)、中度阳性(10 mm≤硬结平均直径<15 mm)和强阳性(硬结平均直径≥15 mm或<15 mm但局部出现迁延症状)[4-5]。

3.基因分型方法：为了解菌株间同源性，按照达安基因生物有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒的步骤，提取结核分枝杆菌DNA。采用Khosravi等[6]描述的DTM-PCR分型法进行菌株分型；采用MIRU分型方法选取国际标准24位点(MIRU02、Mtub04、ETRC等)，经PCR及凝胶电泳[7]后计算基因各位点重复序列的拷贝数，获得一、二代病例所有分离菌株基因分型。

4.其他指标：计算家庭密切接触者结核分枝杆菌感染率、MDR-PTB发病例数和一、二代病例的耐药表型。

三、统计学处理

采用Excel 2013和SPSS 22.0软件进行数据的统计处理和分析。计数资料以“例(构成比/百分率，%)”描述，组间差异的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。将MIRU分型结果的各位点重复序列拷贝数导入MIRU-VNTR在线分析平台(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)，采用非加权配对算术平均法(UPMGA)构建分离菌株MIRU最小生成树。

结 果

一、家庭密切接触者人口学特征与结核感染情况

166例MDR-PTB患者共有282名家庭密切接触者，平均每例患者家庭密接者1.7名，其中女性居多，占56.74%。年龄分布在3～71岁，平均年龄为(39.3±18.4)岁。282名家庭密接者的TST检测阴性率、一般阳性率、中度阳性率和强阳性率分别为53.90%、8.51%、10.64%和26.95%；结核感染率为37.59%(106/282)。家庭密切接触者人口学特征及TST检查结果见表1。

表1 家庭密切接触者人口学特征及结核菌素皮肤试验结果

二、不同性别、年龄家庭密切接触者感染情况

不同性别、年龄家庭密切接触者感染率的差异均无统计学意义，具体见表2。

表2 不同特征家庭密切接触者结核菌素皮肤试验情况

三、家庭密切接触者肺结核诊断情况

282名家庭密切接触者中有疑似症状者9例(3.19%)；行胸片检查者274名，胸片异常者8例(2.92%)；对有咳嗽咳痰症状或TST强阳性或胸片异常的106例行痰结核分枝杆菌细菌学检查，其中病原学阳性者4例(3.77%)，均为MDR-PTB患者，发病率为1.42%。

四、家庭密切接触者感染结核分枝杆菌表型耐药谱分析

4例二代MDR-PTB患者分布于3个家庭(共计8名密切接触者)，其中，可能的传播链为父母→子女2对、夫→妻1对、姐→妹1对。比较家庭二代病例与一代病例表型耐药谱发现，3例表型耐药谱相同，1例不同。具体见表3。

表3 家庭一代病例与二代病例基本情况及表型耐药谱比较

五、家庭二代病例与一代病例基因分型

3个家庭共有3例一代病例和4例二代病例，对收集到的6株结核分枝杆菌(1株二代病例菌株丢失)进行24位点MIRU-VNTR基因分型，结果显示，2个家庭4例病例的基因分型结果完全一致，1个家庭2例病例仅1个位点有差异(图1)。同时，对3个家庭的6株结核分枝杆菌进行DTM-PCR分型，结果均为北京株。

图1 3个家庭的6株结核分枝杆菌MIRU基因分型结果

讨 论

结核病的传播方式主要是近距离飞沫传播，家庭密切接触者发生结核病的风险较大。国内关于涂阳肺结核患者家庭密切接触者传播模式报道较多[8-9]，但关于MDR-TB家庭密切接触者传播机制的相关报道较少。本研究对武汉市MDR-PTB患者的家庭密切接触者进行感染、发病和菌株同源性的观察，探讨MDR-PTB家庭传播机制。

本研究中282名家庭密切接触者的结核感染率为37.59%，高于Lu等[4]对中国东南部6个城市的研究(28.0%)和韩志英等[10]采用结核感染T细胞斑点试验检测的21.95%，也高于2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查人群28.3%的TST阳性率(硬结平均直径≥10 mm)[11]。由此可见，本研究MDR-PTB患者家庭密切接触者的结核感染率高于普通人群，呈现高感染状况。国外文献大多是MDR-TB接触者结核病发病的横断面调查，随访的报道比较少[2,12]。MDR-TB患者的家庭密切接触者中MDR-TB的发病率较高，Javaid等[2]在对610名家庭密切接触者的研究中发现了41例(17.4%)MDR-TB患者，远高于本研究中家庭密切接触者MDR-PTB发病率(1.42%)，这可能与该人群国家为HIV高发国有关，而Vella等[12]在对793名密切接触者的研究中发现了14例(1.8%)MDR-TB患者，这一结果与本研究相似，但均远高于一般人群的MDR-TB发病率。

MDR-TB可导致家庭灾难性支出患者的比例达到80%，当一个家庭出现2例及以上二代MDR-TB病例时会给患者心理及家庭经济造成巨大伤害[13-14]。本研究中282名家庭密切接触者发生MDR-PTB患者4例，分布于3个家庭，其中1个家庭出现3例MDR-PTB患者，且以父母子女间传播比例最高，其次为夫妻间和兄弟姐妹间传播，提示家庭接触是MDR-PTB传播的高危因素，与姚芳等[8]报道的初治涂阳肺结核患者家庭接触者中父母肺结核检出率最高一致，但与杜雨华等[9]报道的夫妻间传播率较高有所差异，但由于样本量太少，这一传播机制还有待大样本进一步证实。对于家庭密切接触者的发病风险时间，有文献报道，MDR-TB感染2年内发病的风险最高[15]，这与本研究发现的二代病例与一代病例发病时间间隔为15 d至12个月，全部二代病例在1年内发病有所不同。故笔者认为，对MDR-PTB患者的家庭密切接触者应至少追踪随访1年，以早期发现家庭二代病例并及时治疗。

通过表型药物敏感性试验结合基因分型技术可确定家庭病例间的传播链。本研究显示，3例二代病例的表型耐药谱与一代病例一致，1例不一致。不一致的可能原因为：一是二代病例从其他途径感染，非家庭内传播；二是虽然是家庭内传播，但也会发生不同抗结核药品药物敏感性试验稳定性不一致的情况，比如，异烟肼和利福平的稳定性最高，其他抗结核药品稳定性较差，可重复性也较差，这就可能导致家庭病例之间利福平和异烟肼的耐药检测结果一致，而乙胺丁醇、链霉素、卡拉霉素和左氧氟沙星等的表型耐药谱不一致。本研究中，仅有1例二代病例比一代病例增加了链霉素耐药，认为可能是不同的抗结核药品药物敏感性试验稳定性不一致所致。

进一步对结核分枝杆菌进行基因分型，以确定家庭病例分离菌株之间是否有同源性，探索病例之间是否存在传播链。MIRU-VNTR分型方法是一种简便快速的结核分枝杆菌基因分型方法，是结核病分子流行病学研究中的重要工具，可用于探索结核病传播机制、接触者调查和同源性调查[16]。虽然目前全基因组测序的费用进一步降低，使其越来越多地应用于结核分枝杆菌的基因分型，但MIRU-VNTR分型仍然不失为一种低成本且快速的分型方法。MDR-TB家庭内传播基因分型的报道较少，且多为个例或少数报道。本研究采用国际标准24位点MIRU-VNTR分型，发现6例MDR-PTB患者中有4例的基因型完全相同，另2例也仅1个位点不同。如果以1个位点以内为成簇定义，则可认为6例MDR-PTB患者全部为成簇病例，这与Cavany等[17]在配对的结核病密切接触者中发现基因分型成簇率为79%的结果相似，提示结核分枝杆菌家庭内传播的可能性极高。

综上所述，武汉市MDR-PTB患者家庭密切接触者存在较高的家庭内传播风险，应当对MDR-PTB患者家庭密切接触者做好宣传教育、筛查及随访，减少MDR-PTB的家庭内传播。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献周燕和周萌：实施研究、数据收集、整理及统计分析、撰写及修改文章；彭军: 实施研究、数据整理及统计分析、撰写及修改文章：段琼红: 查阅文献、修改文章；陈军：匹配标本，实施细菌学、分子生物学检测，整理部分数据；周美兰：整理部分数据、查阅文献、修改文章；张云侠和梁军：酝酿和设计实验、筛选研究对象、查阅文献、修改文章