黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响*

孙鹏洲,罗珠珠,**,李玲玲,牛伊宁,王晓菲,田建霞,刘家鹤

(1. 甘肃农业大学资源与环境学院 兰州 730070;2. 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室 兰州 730070)

反硝化作用作为土壤中氮素损失的重要途径和温室气体N2O 的主要来源[1-2],主要由4 种不同的酶诱导,即硝酸盐还原酶(nitrate reductase,Nar)、亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Nir)、一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase,Nor)和氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,Nos),其中亚硝酸还原酶基因(nirK/nirS)被广泛用作反硝化细菌的标记基因[3-4]。亚硝酸还原酶包含结构不同但功能相同的两种酶,一种由含细胞色素cd1 的nirS基因编码,另一种由含铜基的nirK基因编码[5],这两种酶功能虽相同,但催化位点和结构存在差异,一般不会同时共存于同一反硝化细菌中,它们代表着两个生态特性不同的反硝化细菌类群,在环境中占据着不同的生态位[6]。研究认为nirS基因型的反硝化细菌具有更高的丰度,在环境中占主导地位,而nirK型反硝化细菌更广泛存在于微生物群落中[5],涵盖了更为多样的分类单元。

nirK和nirS两种基因型反硝化细菌群落组成和多样性与植被类型和土壤理化性质密切相关[7]。Heylen 等[8]的研究表明nirS基因在β-变形菌纲(Betaproteobacteria)中较多,且在科和属水平上与16S rRNA 系统发育关系一致,而nirK基因普遍存在于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria),且与16S rRNA基因系统发育关系不一致。王婷等[9]的研究表明,土壤中nirK型反硝化细菌主要与假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和根瘤菌属(Rhizobium)的反硝化细菌具有较近的亲缘关系,而nirS型反硝化细菌主要与劳尔氏菌(Ralstonia)和红长命菌属(Rubrivivax)有较近的亲缘关系。大量研究表明,nirK反硝化基因型细菌存在于农田[10]、草地[11]和森林[12]等环境中,并且发现全氮、硝态氮和pH 的变化会影响nirK型反硝化微生物的群落结构和多样性[13]。韩晓丽等[14]研究表明,pH、土壤有机碳、土壤铵态氮和硝态氮等环境因子是影响土壤反硝化细菌群落结构及组成的关键因子。

紫花苜蓿(Medicago sativa)属多年生豆科牧草,因其抗旱、耐瘠、优质、高产的特性,在我国西部黄土高原地区被广泛种植,仅甘肃省紫花苜蓿种植面积达到74.67 万hm2,位居全国第一[15]。长期种植紫花苜蓿能够增加土壤中碳氮含量[16],但土壤水分和有效磷含量被严重消耗[17],而关于土壤微生物群落的研究相对较少,且已有的研究大多局限于细菌[18-19]和真菌[20],如Agnello 等[21]对法国地区苜蓿植被恢复潜力的研究发现,种植苜蓿能够有效提高根际微生物活性。Yang 等[22]对不同土地利用方式细菌群落的研究发现,苜蓿种植能提高细菌群落多样性。马欣等[23]对黄土高原不同种植年限苜蓿地真菌群落的研究表明,不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落结构组成相似性高,但其优势菌群分布受种植时间的影响。但是,有关黄土高原参与土壤氮循环的功能微生物特别是反硝化微生物的研究几乎未见报道,而反硝化作用是旱地土壤氮素损失不可忽视的一个过程,苜蓿长期种植过程中土壤养分、水分以及温度等多种因子的变化会影响土壤反硝化作用[24-26],特别是土壤中参与氮循环的反硝化微生物的活性受到有效磷含量的限制[27]。因此,我们假设,长期种植紫花苜蓿会改变土壤中反硝化微生物群落构成和多样性,且具有相同功能的nirK和nirS型反硝化细菌对长期种植紫花苜蓿引起的土壤理化性质变化的响应可能并不一致。本研究采用荧光定量PCR 技术、Illumina MiSeq 高通量测序技术以及分子生态网络的构建,研究长期种植紫花苜蓿对西北黄绵土nirK和nirS反硝化基因丰度、群落组成的影响,评估驱动nirS和nirK型反硝化细菌群落结构变化的环境因子,为深入探究长期种植紫花苜蓿对土壤反硝化微生物的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于甘肃省定西市安定区李家堡镇甘肃农业大学旱作农业综合试验站(35°28′N,104°44′E),该地区属中温带半干旱区,平均海拔2000 m,年均日照时数2476.6 h,年均太阳辐射592.9 kJ·cm-2,年均气温6.4 ℃,≥0 ℃年均积温2933.5 ℃,≥10 ℃年均积温2239.1℃,无霜期为140 d,年均降水量390.9 mm,年蒸发量1531 mm,是典型的旱作雨养农业区,土壤类型为黄绵土。

1.2 试验设计

试验以2019 年(种植年限为2 年,L2019)、2012年(种植年限为9 年,L2012)、2003 年(种植年限为18 年,L2003)建植的紫花苜蓿草地为研究对象,玉米农田(Farmland)作为对照,共4 个处理,每个处理设3 次重复,小区面积3 m×7 m,间隔0.5 m,随机区组排列。苜蓿品种为‘陇东紫花苜蓿’,建植时施纯氮105 kg·hm-2,纯P2O5105 kg·hm-2,后期均未进行施肥、灌水。农田采用连作种植模式,种植作物为当地主栽作物玉米(Zea mays),参试品种为‘先玉335’,种植密度5.25 万株·hm-2,施纯氮200 kg·hm-2,P2O5105 kg·hm-2,所有肥料在播种时作为基肥一次施入,生育期不再追肥、灌溉。

1.3 土壤样品采集与处理

于2020 年6 月下旬(苜蓿第1 茬盛花期和玉米拔节期)采样,在每个小区内采用五点取样法取耕层(0～30 cm)土壤,将样品充分混匀,去除土壤中的杂质,将土样分为两份,一份装入无菌离心管,在田间放入有冰袋的泡沫盒中带回实验室置于-80 ℃冰箱保存,用于土壤反硝化微生物DNA 提取;一部分土样保存于4 ℃冰箱中,用于测定土壤硝态氮、铵态氮和微生物量碳氮,剩余土样待风干后分别过2 mm、1 mm 和0.149 mm 筛用于土壤理化性质的测定。

1.4 土壤理化性质的测定

土壤理化性质按照《土壤农化分析》[28]的方法测定。土壤pH 采用电位法(土水比1∶2.5)测定;土壤含水率采用烘干法测定;土壤有机碳采用重铬酸钾-浓硫酸外加热法测定;全氮采用H2SO4消煮-凯氏定氮法测定;全磷采用H2SO4-HClO4消煮,钼锑抗比色法测定;速效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提,钼锑抗比色法测定;硝态氮和铵态氮采用2 mol·L-1KCl 溶液浸提,半自动化学间断分析仪(Smart Chem AST-6500S,意大利)测定;微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提,碳氮联合分析仪(Jena multi N/C 2100s,德国)测定。

1.5 土壤反硝化微生物高通量测序

土壤微生物DNA 提取:依照Power Soil® DNA试剂盒提取土壤微生物群落总DNA,用琼脂糖凝胶(1%)电泳检测待测DNA 的纯度,用C21H12BrN3染色后在凝胶成像系统进行检测。

荧光定量PCR:土壤微生物DNA 提取后,利用目标基因引物进行PCR 扩增,PCR 仪为博日Line-Gene9600plus 型荧光定量PCR 仪,PCR 试剂为ChamQ SYBR Colorq PCR Master Mix(2X) (南京诺唯赞生物科技有限公司),引物和反应条件如表1 所示。PCR扩增产物用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司,美国)进行纯化后回收。

表1 反硝化基因的引物序列及PCR 反应条件Table 1 Primer sequences of denitrifying genes and PCR reaction conditions

Illumina Miseq PE300 测序:参考电泳初步定量结果,将PCR 产物用QuantiFluor™-ST 蓝色荧光定量系统(Promega 公司,北京)进行定量检测,之后将每个样本按要求进行混合。利用聚合DNA 产物构建Miseq 文库,然后借助高通量测序平台(Illumina Miseq PE300)测序。以上过程均委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.6 土壤反硝化微生物生态网络构建

选取土壤反硝化细菌OTU 间的Spearman 相关系数r＞0.6,显著性P＜0.05 的物种OTU,利用R 软件中“igraph”和“psych”包进行微生物群落相关性网络构建,应用Gephi 0.9.2 软件进行网络可视化分析[29],并依据“度(Degree) ＞5”及“中介中心值(betweenness centrality value) ＜1000”的准则来选取节点作为关键物种[30]。

1.7 数据处理

利用上海美吉公司I-sanger 云平台(https://cloud.majorbio.com/)进行反硝化细菌群落结构和多样性分析,采用Excel 2019 软件对反硝化细菌群落结构进行数据统计,利用SPSS 21.0 对土壤理化因子和反硝化微生物群落相对丰度进行单因素方差分析(Anova),采用多重比较法(Duncan)进行处理间差异显著性分析,运用 Canoco 5 软件对反硝化细菌属水平与理化因子之间进行冗余分析(RDA),并用Adobe Illustrator CS6 软件对图表进行修饰。

2 结果与分析

2.1 苜蓿种植年限对土壤理化性质的影响

不同处理土壤理化性质如表2 所示,紫花苜蓿土壤水分显著低于玉米农田(P＜0.05),紫花苜蓿种植年限对土壤水分无明显影响;土壤有机碳和全氮随紫花苜蓿种植年限的延长呈增加趋势,其中L2003处理土壤有机碳含量显著增加(P＜0.05),L2012和L2003处理土壤全氮含量显著增加(P＜0.05);土壤硝态氮和有效磷含量紫花苜蓿土壤显著低于农田(P＜0.05);土壤铵态氮为L2019、L2012紫花苜蓿土壤均显著高于玉米农田(P＜0.05);土壤微生物量碳和微生物量氮含量紫花苜蓿土壤均显著高于玉米农田(P＜0.05);土壤pH 处理间无显著差异。

表2 紫花苜蓿种植年限对土壤理化性质的影响Table 2 Effects of planting years on soil physical and chemical properties of Medicago sativa

2.2 苜蓿种植年限对土壤反硝化基因丰度的影响

不同处理反硝化基因拷贝数如图1 所示,nirK基因拷贝数明显高于nirS基因,其中nirK基因拷贝数为4.91×107～6.33×107copies·g-1干土,nirS基因拷贝数为1.02×107～1.86×107copies·g-1干土。nirS基因拷贝数随紫花苜蓿种植年限的延长呈增加趋势,L2003显著高于L2019和玉米农田(P＜0.05),但nirK基因拷贝数处理间无明显差异。

图1 紫花苜蓿种植年限对土壤反硝化基因nirK 和nirS拷贝数的影响Fig.1 Effects of Medicago sativa planting years on copies of soil denitrifying genes of nirK and nirS

反硝化基因拷贝数与土壤理化因子相关性分析表明(表3),nirK反硝化基因拷贝数变化对土壤理化因子无明显响应,而nirS反硝化基因拷贝数与土壤有机碳、全氮、微生物量碳呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关关系,与土壤水分、有效磷呈显著负相关关系(P＜0.05)。

表3 土壤反硝化基因拷贝数与土壤理化因子相关分析Table 3 Correlation analysis of soil denitrifying gene abundance and soil physicochemical properties

2.3 苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落多样性的影响

α 多样性指数(表4)表明,苜蓿种植年限对反硝化细菌群落多样性和丰富度无显著影响。进一步基于Bray_Curtis 算法计算样本间距离矩阵进行PCoA分析(图2),结果表明,nirK型反硝化细菌(图2A)PC1 值和PC2 值分别为53.50%和18.23%,L2012、L2003主要分布于第1、4 象限,L2019主要分布于第1、2 象限,而农田土壤主要分布于第3 象限;nirS型反硝化细菌(图2B) PC1 值为37.54%,PC2 值为13.33%,L2019、L2012和L2003主要分布于第1、4 象限,而农田在PCoA1 轴上的坐标为负值,与其余4 个处理明显分开。采用基于距离矩阵的PERMANOVA 分析发现,两类反硝化细菌群落在不同处理间均存在显著差异(P＜0.05)。

图2 不同种植年限紫花苜蓿土壤反硝化细菌PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis of soil denitrifying bacteria with different planting years of Medicago sativa

2.4 苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落结构的影响

土壤nirK和nirS两类反硝化菌群中含有大量分类地位不明确的微生物,丰度分别为31.78%～63.02%、33.81%～51.79%;已明确注释的微生物中,均以变形菌门(Proteobacteria)为主(表5),相对丰度分别为36.98%～68.22%和48.21%～66.19%。紫花苜蓿种植年限对nirK型反硝化细菌变形菌门丰度未产生明显影响,但显著提高了nirS型反硝化细菌变形菌门丰度(P＜0.05)。

表5 紫花苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落相对丰度的影响Table 5 Effects of Medicago sativa planting years on the relative abundances of soil denitrifying bacterial communities

属水平下,nirK型反硝化细菌已注释属为13 种,优势属主要有副球菌属(Paracoccus,1.10%～39.94%)、无色杆菌属(Achromobacter,0.07%～12.50%)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium,0.50%～7.60%)。副球菌属相对丰度紫花苜蓿土壤显著高于玉米农田(P＜0.05),且其丰度随着紫花苜蓿种植年限延长逐渐增加;无色杆菌属丰度玉米农田显著高于紫花苜蓿土壤(P＜0.05),且随着紫花苜蓿种植年限延长逐渐降低;中华根瘤菌属相对丰度随着种植年限的延长其丰度逐渐降低,且玉米农田中相对丰度高于紫花苜蓿土壤,但处理间无明显差异。同时,本研究还发现,中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)仅在紫花苜蓿土壤中检测到,而Ensifer、Starkeya、产碱菌属(Alcaligenes)仅在玉米农田中检测到。

已注释的nirS型反硝化细菌共有7 属,优势属为罗河杆菌属(Rhodanobacter,1.42%～5.20%),同时检测到部分相对丰度较低的属,如固氮螺菌属 (Azospirillum,0.58%～0.73%)、假单胞菌属(Pseudomonas,0.01%～0.67%)、Azospira(0.03%～0.32%)。Azospira相对丰度玉米农田显著高于紫花苜蓿土壤(P＜0.05),其余属处理间均无显著差异。另外,紫花苜蓿土壤中检测到了博德特氏菌属(Bordetella)和磁螺菌属(Magnetospirillum)等稀有物种,玉米农田检测到了草螺菌属(Herbaspirillum)。

为进一步揭示影响土壤反硝化细菌群落结构的主要环境因子,以土壤反硝化细菌属水平群落丰度为响应变量,土壤理化因子为解释变量进行冗余分析。结果表明,nirK型反硝化细菌群落(图3A)在两个排序轴上的解释度为77.35%和9.16%,Monte Carlo检验表明,土壤水分(P=0.002)和有机碳(P=0.02)对nirK型反硝化细菌群落结构产生显著影响;nirS型反硝化细菌群落(图3B)在两排序轴上的解释度分别为46.00%和32.40%,土壤有效磷(P=0.006)对nirS型反硝化细菌群落构成产生显著影响。

图3 不同种植年限紫花苜蓿土壤反硝化细菌与土壤理化因子RDA 分析Fig.3 Redundancy analysis of soil denitrifying bacteria community structure and physicochemical properties in different treatments of Medicago sativa planting years

2.5 土壤反硝化细菌群落生态网络分析

基于OTU 水平构建反硝化细菌分子生态网络,其中nirK型反硝化细菌生态网络(图4A)共得到101 个节点,429 条边,正相关的边所占比例为98.37%,负相关的边所占比例为1.63%,平均度为7.27,平均加权度为10.03,网络直径为9.00,图密度为0.061,平均聚类系数为0.496,模块化系数0.55,表明具有模块结构。nirK型反硝化微生物生态网络共得到4 个模块,基于节点度大于5 和中介中心值小于1000 的标准,得到66 个关键物种OTU,主要分布在Module 1和Module 2,Module 3 和Module 4 中分布较少,关键物种OTU 主要隶属于副球菌属、无色杆菌属、中华根瘤菌属、Bosea以及未明确注释(unclassified)的反硝化细菌。nirS型反硝化细菌生态网络(图4B)共得到274 个节点,1793 条边,所有的边均为正相关,网络平均度为12.27,平均加权度为17.64,网络直径为9,图密度为0.04,平均聚类系数为0.35,模块化系数为0.48,表明具有模块结构。nirS型反硝化细菌生态网络共得到5 个模块,基于节点度大于5 和中介中心值小于1000 的标准,得到219 个关键物种OTU,主要分布在Module 1、Module 2 和Module 3,Module 4 和Module 5 分布相对较少,且关键物种OTU 主要为未明确分类(unclassified)的反硝化细菌。

图4 土壤反硝化细菌群落网络分析Fig.4 Network analysis of soil denitrifying bacteria community

3 讨论

长期种植紫花苜蓿显著增加土壤碳、氮养分的同时也造成土壤水分和磷素的亏缺,种植年限引起土壤理化因子的改变最后造成反硝化基因与关联群落差异。此前已有研究发现稻田土壤中反硝化功能基因nirK的拷贝数高于nirS基因拷贝数[31],也有研究发现旱地土壤反硝化功能基因nirS拷贝数高于nirK的拷贝数[4,32]。本试验条件下,紫花苜蓿地和玉米农田中nirK反硝化基因拷贝数均明显高于nirS反硝化基因拷贝数,说明具有nirK基因的微生物是黄绵土区主要的反硝化微生物。nirS基因拷贝数随紫花苜蓿种植年限的延长显著增加(P＜0.05),而nirK基因无显著变化,说明nirK和nirS型反硝化细菌在土壤中可能占据着不同的生态位[33]。研究同时发现,nirK基因拷贝数在紫花苜蓿地与农田之间无显著差异,而nirS基因拷贝数表现为L2003处理显著高于玉米农田(P＜0.05),原因可能是nirS型反硝化细菌对长期种植紫花苜蓿过程中土壤碳氮积累的响应较为迅速,进而导致nirS微生物体现出差异[34],而nirK型反硝化细菌则受到土壤环境因子、作物类型和根系分泌物的联合调控[35-36]。

反硝化微生物广泛存在于细菌和古菌中,部分真菌线粒体中也发现反硝化作用[37]。本研究发现黄绵土中参与反硝化作用的微生物主要为细菌,也有部分古菌,同时还存在许多未明确分类的nirK和nirS基因序列,其中是否存在具有反硝化作用的真菌,还需要进一步的探究。本研究所检测到的反硝化细菌中未明确分类的相对丰度较高,但已分类的反硝化细菌主要以变形菌门(Proteobacteria)为主,与前人[37]的研究结果一致,可能是由于变形菌中包含了各种营养类型的细菌,且其在土壤中的分布较为广泛[38]。土壤理化性质在一定程度上决定着土壤微生物结构。在属分类水平上,副球菌属作为各土壤样本中所共有的、分布较为广泛的nirK型反硝化细菌优势属,表现出对紫花苜蓿地生境的偏好(18.18%～39.94%)和对玉米农田生境的偏离(1.10%),无色杆菌属和中华根瘤菌属趋势刚好相反,表现出对玉米农田生境的偏好和对紫花苜蓿地生境的偏离。已有研究表明土壤nirK型反硝化细菌群落结构的差异主要是多种因子综合影响的,例如土壤水分[39]、全氮[40]、有机碳[41]等,Bremer 等[42]发现植被类型的改变对nirK反硝化微生物群落结构也具有显著的影响。因此,紫花苜蓿通过固氮作用和凋落物的分解增加土壤中可利用的碳源和氮源的同时,使得土壤nirK型反硝化细菌群落结构发生显著变化。其次,本研究中,nirK型反硝化细菌群落构成受水分的显著影响,与刘若萱等[43]的研究结果一致。与稻田土壤和热带森林土壤中nirS型反硝化细菌主要来自于嗜盐单胞菌属(Halomonas)和贪铜菌属(Cupriavidus)不同[44-45],黄绵土nirS型反硝化细菌优势属为罗河杆菌属,这可能与土壤类型有关,因为部分细菌存在环境特异性[46]。固氮螺菌属和假单胞菌属是少量存在于各土壤样本中的nirS型反硝化细菌,固氮螺菌属可以促进反硝化作用,其相对丰度和氮素水平密切相关能够加快脱氮过程[47],假单胞菌属具有代谢多样性,广泛存在于各种环境中[7]。另外,本研究还发现长期种植紫花苜蓿使部分反硝化微生物凋亡,如存在于玉米农田土壤的产碱菌属和草螺菌属并未在紫花苜蓿土壤中检测到。同时,长期种植紫花苜蓿后也促生了一些特有菌群,例如仅存在于紫花苜蓿土壤中的中慢生根瘤菌属和柠檬酸杆菌属。湛钰等[44]对磷差异调控水稻(Oryza sativa)土壤反硝化微生物群落结构影响的研究表明,含nirS基因的微生物群落对土壤磷含量的变化较为敏感,结合本研究冗余分析结果,推测可能是因为紫花苜蓿地和玉米地磷含量的差异导致nirS基因微生物群落结构发生变化。周婷婷等[7]发现,土壤全氮含量也会影响土壤nirS型反硝化细菌生长,其次作物根系分泌物能诱导和刺激特殊种群的细菌在根际定殖,某些微生物类群对特定环境因子的嗜好,导致出现了生态位分化现象[48]。因此,土壤中反硝化细菌群落结构的变化并非单一因子驱动,黄土高原半干旱区土壤反硝化细菌群落组成的变化是多种因子共同驱动的。

自然环境下的任何物种都与其他物种形成复杂的生态网络结构,生态网络的结构特性不仅可以揭示物种之间的复杂关系,还可以表征生态网络结构的稳定性[49]。本研究构建了两类反硝化微生物生态网络,发现nirK型反硝化细菌的生态网络具有更高的平均聚类系数,而nirS型反硝化细菌拥有更多的连线和节点数目,这表明nirK型反硝化微生物的网络结构更为简化,且网络中节点之间的联系更加紧密,而紧密联系在一起的网络所具有的较低模块性也使其更易受环境波动的影响[50],这可能对维持土壤微生物生态系统的健康性和稳定性造成不利影响。此外,本研究所涉及的nirS型反硝化细菌的生态网络节点之间均是正相关,而nirK型反硝化细菌的生态网络节点之间具有一定的负相关,说明nirK型反硝化微生物之间存在一定程度的养分竞争关系,而nirS型反硝化微生物之间存在更为普遍的协同合作效应。

4 结论

长期种植紫花苜蓿显著增加土壤碳、氮养分的同时也造成土壤水分和磷素的亏缺,种植年限引起土壤因子的改变最后造成反硝化基因与关联群落差异。尽管nirK基因拷贝数明显高于nirS基因拷贝数,但紫花苜蓿种植显著提高了nirS基因拷贝数,而对nirK基因并无明显影响。本研究土壤反硝化细菌大多隶属于变形菌,其中nirK型反硝化细菌优势属为副球菌属、无色杆菌属和中华根瘤菌属,nirS型反硝化细菌优势属为罗河杆菌属。土壤水分和有机碳是驱动nirK型反硝化细菌群落结构发生变化的主导因子,而土壤磷素是驱动黄绵土nirS型反硝化细菌群落结构变化的最主要因素。微生物生态网络分析表明nirK和nirS型反硝化细菌群落间均具有较强的协同合作关系。