基于EpCAM核酸适配体分子信标的构建及其对胃癌细胞的靶向成像研究*

靳思涵，李佳宁，孙 芳，李 鑫，张书睿，李婉明△

(1.中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室/医学细胞生物学教育部重点实验室/生命科学学院细胞生物学教研室，沈阳 110122；2.中国医科大学临床三系，沈阳 110122；3.中国医科大学第一临床学院，沈阳 110001)

胃癌是全球第5大常见的癌症，也是导致癌症相关死亡的第3大原因[1]。胃癌早期诊断率较低，导致患者发现时已进入晚期，易转移，预后差，生存率降低[2]。因此，设计特异性、灵敏度更高的靶向诊断探针在实现胃癌早期诊断中具有重要的价值。

核酸适配体(aptamer)是一类能特异性识别靶标的分子探针，可以折叠成不同的三维空间结构(如发夹、假结等)与靶标发生结合，又称为“化学抗体”[3]。与蛋白类抗体相比，核酸适配体因具有高亲和力和特异性、分子量小、稳定性高、易于化学修饰等优势，成为肿瘤早期诊断领域的理想分子探针[4]。然而常规的核酸适配体荧光探针往往是“常亮式”的，容易产生假阳性，需要经过多次的洗涤步骤，操作过程繁杂，难以完成某些特定靶标的准确检测[5]。核酸适配体分子信标是一种“激活式”分子探针，使用时操作简单、背景低，可以高选择性高特异性地结合目的分子，不需要经过洗涤步骤，即可一步法完成原位实时检测。本研究拟在靶向上皮细胞黏附分子(epidermal growth factor receptor，EpCAM)的核酸适配体SYL3的基础上，设计构建“激活式”分子探针——核酸适配体分子信标MAB-SYL3L，分析其亲和性、特异性、生物活性及其对胃癌细胞的靶向识别，为核酸适配体分子信标的应用及胃癌的早期诊断提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞SGC-7901及人胚肾上皮细胞HEK-293均由实验室保存；实验室中所需适配体及文库(Library)均委托上海生工生物有限公司合成，以HPLC方式纯化。TU-1901紫外-可见分光光度计购自北京普析通用有限责任公司；荧光倒置显微镜Axio observer Z1购自德国Zeiss公司；流式细胞仪FACSalibur购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

SGC-7901细胞和HEK-293细胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2核酸适配体分子信标的构建

根据EpCAM的核酸适配体SYL3的二级结构特征，在保留功能性结合区域的基础上进行截短处理，截短序列命名为SYL3L。在此基础上，根据分子信标设计的3大原则：茎部序列不能过长，序列中GC含量不能过高，荧光基团和淬灭基团之间的距离适宜，设计构建核酸适配体分子信标MAB-SYL3L，即在5′末端添加荧光基团FAM，在3′末端添加淬灭基团BHQ1。

1.2.3分光光度计检测MAB-SYL3L的荧光情况

将合成的FAM-SYL3L和MAB-SYL3L溶于PBS中，取100 μL加入比色杯中，利用TU-1901紫外-可见光分光光度计检测溶液的荧光情况。

1.2.4流式细胞术检测MAB-SYL3L与不同细胞系的结合情况

取对数生长期的SGC-7901细胞和HEK-293细胞用无酶细胞消化液消化后制成细胞悬液。分别加入FAM-SYL3L或MAB-SYL3L(终浓度250 nmol/L)4 ℃孵育30 min，PBS洗涤2次，加入300 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光信号。

1.2.5Western blot检测不同细胞系中EpCAM的表达情况

收集对数生长期的SGC-7901细胞和HEK-293细胞，加入细胞裂解液冰上孵育20 min，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集蛋白上清液，通过BCA法测定蛋白浓度。向蛋白样品中加入5 × loading buffer，煮沸5 min。取煮沸后样品注入加样孔，80 V 30 min，120 V 60 min 电泳。电泳结束后80 V恒压转膜，封闭60 min后进行抗体孵育，EpCAM抗体购自英国Abcam公司，一抗在4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，结束后通过成像系统进行结果分析。

1.2.6流式细胞术检测MAB-SYL3L的亲和力

配制不同浓度的MAB-SYL3L(终浓度分别为0、1 nmol/L、2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L、16 nmol/L、32 nmol/L、64 nmol/L、128 nmol/L、256 nmol/L、512 nmol/L)，利用流式细胞仪检测细胞的荧光信号。利用SigmaPlot软件对各浓度MAB-SYL3L与SGC-7901细胞结合的平均荧光强度进行分析，得到相关结合曲线及Kd值。

1.2.7流式细胞术检测不同温度下MAB-SYL3L的结合能力

收集对数生长期的SGC-7901细胞，分别与MAB-SYL3L(终浓度250 nmol/L)在4 ℃、25 ℃和37 ℃下孵育30 min，PBS洗涤2次后，加入300 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光信号。

1.2.8荧光显微镜观察MAB-SYL3L对SGC-7901细胞的靶向成像

取对数生长期的SGC-7901细胞铺于激光共聚焦小皿内，置于细胞培养箱过夜培养后取出，PBS洗涤细胞，分别加入FAM-SYL3L和MAB-SYL3L，在4 ℃孵育30 min后，分别进行洗涤步骤或无洗涤步骤，使用荧光倒置显微镜观察并拍照。

2 结 果

2.1 MAB-SYL3L的构建

将靶向EpCAM的核酸适配体 SYL3从79 nt长度截短至43 nt的截短序列SYL3L(图1)，在此基础上构建核酸适配体分子信标MAB-SYL3L(图2A)。紫外-可见分光光度计检测结果如图2B所示，直接连接荧光基团的FAM-SYL3L在518 nm波长左右处可见明显的荧光峰，而MAB-SYL3L上荧光基团和淬灭基团间发生能量共振转移，没有检测到任何荧光信号。

图1 SYL3截短成SYL3L的二级结构模拟图

A：MAB-SYL3L的二级结构模拟图；B：紫外-可见分光光度计检测MAB-SYL3L的荧光信号。

2.2 MAB-SYL3L的细胞选择性

与对照序列Library比较，FAM-SYL3L和MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的荧光结合峰发生明显的右移，而与HEK-293细胞的荧光结合峰几乎没有发生右移，见图3A。HEK-293细胞的EpCAM呈现低表达，而SGC-7901细胞的EpCAM呈现高表达，见图3B。

A：流式细胞术检测MAB-SYL3L与不同细胞系的结合情况；B：Western blot检测EpCAM在不同细胞系中的表达情况。

2.3 MAB-SYL3L的亲和性

随着MAB-SYL3L浓度的增加，SGC-7901细胞的荧光结合峰逐渐发生右移，增加到一定程度后，荧光结合峰右移程度逐渐减弱，达到饱和状态，见图4A。MAB-SYL3L对SGC-7901细胞具有很好的亲和力,见图4B。

A：流式细胞术检测不同浓度MAB-SYL3L与靶细胞的结合情况； B：MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的解离曲线。

2.4 MAB-SYL3L在不同温度下的结合能力

与对照序列Library比较，在室温25 ℃和体内温度37 ℃下，MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的荧光结合峰均发生明显的右移，且结合能力基本上与核酸适配体的筛选温度4 ℃时几乎相同，见图5。

2.5 MAB-SYL3L对SGC-7901细胞的靶向成像

激光共聚焦荧光显微镜观察结果显示，当使用常规的荧光成像步骤操作时，即细胞与探针孵育后通过洗涤步骤去除没有发生结合的探针，与对照序列Library比较，FAM-SYL3L和MAB-SYL3L的细胞表面均能观察到明显的绿色荧光。当探针与细胞孵育后不经过洗涤步骤直接观察时，FAM-SYL3L和FAM-Library具有很高的荧光背景，无法实现细胞成像，而MAB-SYL3L荧光背景低，仍然能够清晰观察到细胞表面的绿色荧光，见图6。

图5 MAB-SYL3L在不同温度下与SGC-7901细胞的结合情况

图6 激光共聚焦显微镜观察MAB-SYL3L对SGC-7901细胞的靶向成像(×200)

流式细胞术结果进一步证实，FAM-SYL3L没有经过洗涤步骤，SGC-7901细胞会检测到很高的非特异性荧光；而MAB-SYL3L有无洗涤步骤，SGC-7901细胞荧光结合峰几乎重合，没有非特异性荧光，见图7。

图7 洗涤步骤对MAB-SYL3L与SGC-7901细胞结合的影响

3 讨 论

核酸适配体作为肿瘤早期诊断的靶向分子识别探针，主要是通过结合荧光染料或纳米发光材料等完成对肿瘤细胞的靶向成像[6-7]。然而，传统的核酸适配体分子探针具有恒定的信号，图像对比度受到高背景的严重影响，因此，在使用的过程中需要经过多次洗涤步骤才能清楚地观察到靶向荧光信号，操作不但复杂繁琐，而且在观察细小靶向对象(如外泌体)时难以实现。

分子信标是基于荧光共振能量转移原理设计出的具有茎-环结构的一段寡核苷酸探针，其中环部是目标识别区，茎部是互补序列，荧光基团和淬灭基团分别连接在茎部的2个末端[8]。当目标分子不存在时，两侧互补碱基配对形成双螺旋，分子信标呈发夹结构，使得2个碱基末端的荧光基团和淬灭基团相互接近，并发生能量转移，荧光被淬灭。当目标分子存在时，环部与目标分子结合，导致分子信标的构象改变，荧光基团与淬灭基团分离，能量转移终止，荧光恢复，且荧光强度与目标分子浓度呈正比。因此，利用分子信标对靶标物质进行检测时不需要分离未结合探针即可实现靶标的检测，具有操作简便、快捷、灵敏度高等优点[9-10]。将核酸适配体的靶向识别特性和分子信标的荧光检测性能相结合，构建的一类新型的核酸适配体分子信标具有以下的优点[11]：(1)核酸适配体在分子信标的设计中作为识别单元，只要获得目标物的核酸适配体，就可以设计出相应的分子信标探针并对其进行检测；(2)核酸适配体的靶标类型广泛，在各领域都具有良好的应用前景；(3)核酸适配体对靶标具有高亲和力和高特异性，因此可以明显提高被检测靶标的灵敏度和选择性。

EpCAM也称为CD326，是一种Ca2+非依赖性跨膜糖蛋白，它在上皮组织的基底外侧细胞表面表达[12]。EpCAM参与细胞信号传导、分化、增殖、侵袭和迁移，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[13-14]。作为肿瘤特异性蛋白，EpCAM在>90%的胃肿瘤中过度表达[15]。本研究中构建EpCAM核酸适配体分子信标MAB-SYL3L，采用流式细胞术分别对其亲和性、温度稳定性等进行分析，结果表明MAB-SYL3L保留了核酸适配体SYL3的特性，且与SGC-7901细胞具有高亲和力，Kd值依然在nmol/L级别；此外，MAB-SYL3L在25 ℃和37 ℃仍能保持与SGC-7901细胞的结合力，提示MAB-SYL3L可以应用于室温或体内的实验。

分子信标最大的优势之一就是在检测靶标物质的过程中不需要额外的洗涤步骤，能够实现一步法的特异性检测，因此为了检测MAB-SYL3L的分子信标特性，采用荧光显微镜和流式细胞术分析存在洗涤步骤与否的情况下，核酸适配体探针FAM-SYL3L和构建的核酸适配体分子信标MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的检测情况。荧光显微镜结果显示不经过后续的洗涤步骤时，FAM-SYL3L的细胞荧光信号背景较深，掩盖了细胞膜上的荧光信号，经过洗涤步骤后才可观察到细胞膜表面的荧光；而MAB-SYL3L信噪比较高，几乎没有荧光信号背景，在有无洗涤步骤下均可很好地实现SGC-7901细胞的靶向识别/成像，提示MAB-SYL3L无须洗涤过程即可通过一步法达到检测靶标物质的目的，体现出核酸适配体分子信标MAB-SYL3L对靶标物质检测具有高特异性、高灵敏度并且操作简便的优势。流式细胞术结果也进一步证实这一结论。

综上所述，本研究成功构建了靶向EpCAM的核酸适配体分子信标MAB-SYL3L，建立了一种方便快捷、准确性高的胃癌细胞靶向成像方法，为核酸适配体和分子信标的相关应用及胃癌细胞的靶向成像提供新方法。