SERPINA1在肝癌组织的表达及临床意义*

彭契六，朱春玲，张 磊，韦尚谋，罗佳佳，甘丽英，张 智，韦邦宁

(1.广西国际壮医医院检验科，南宁 530201；2.南宁市第一人民医院肝胆外科,南宁 530022;3.广西国际壮医医院肝胆外科,南宁 530201)

寻找肝癌转移复发的预警分子和预后标志物，预防和降低术后肿瘤复发转移率，已经成为肝癌研究领域的热点[1]。丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(serine protease inhibitor A1,SERPINA1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的主要成员，主要由肝细胞合成[2]。SERPINA1具有强烈的催化反应活性，主要通过与酶的活性部位结合，抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为活性酶，在调节酶活性和蛋白质代谢，以及细胞生长、分化、运动和信号转导方面发挥重要的作用[3]。近年的研究结果显示，SERPINA1与胃癌、口腔扁平细胞癌和结直肠癌的发生、发展和转移预后相关[4-6]，但其在肝癌组织的表达及与肝癌患者预后的关系尚不清楚。本研究旨在分析肝癌组织中SERPINA1表达与肝癌患者术后转移和预后的关系，并在HepG2细胞系中通过慢病毒转染干扰SERPINA1表达，探讨SERPINA1对肝癌细胞侵袭和转移的影响，为肝癌转移的预防和早期干预提供新思路。

1 资料与方法

1.1 肝癌标本

选取2013年1月至2016年6月在南宁市第一人民医院肝胆外科行手术切除的肝癌病例68例和2019年1月至2019年8月在广西国际壮医医院肝胆外科行手术切除的肝癌病例10例，肝癌切除术后收集肝癌组织和癌旁组织(癌组织与正常组织交界处2 cm以内)，-80 ℃保存备用。纳入的全部病例均经病理确诊为肝细胞癌。分析78例肝癌患者相关临床资料，所有纳入的病例均在入组前征得患者及其家属的知情同意。本研究经南宁市第一人民医院伦理委员会(NNSY20160503)和广西国际壮医医院伦理委员会(20181201)批准。

1.2 细胞株和试剂

肝癌细胞株HepG2由中国科学院上海生命科学研究院提供。逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自美国Abcam公司，SERPINA1抗体、荧光二抗购自美国Santa Cruz公司，基质金属蛋白酶9(MMP-9)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)单克隆抗体购自美国Sigma公司，24孔Transwell侵袭小室购自美国Corning公司，Matrigel购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养和细胞转染

HepG2细胞采用DMEM培养基[含10%胎牛血清(FBS)]在37 ℃ 5% CO2环境中培养，当细胞生长至汇合度60%～70%，更换新鲜的培养基并加入适量的病毒悬液，继续培养24 h后，更换新鲜培养基，用嘌呤霉素筛选稳转细胞株。SERPINA1干扰RNA(siRNA)目标序列为5′- GAA CUC ACC CAC GAU AUC A-3′和5′- GAU GAA GCG UUU AGG CAU G-3′。

1.3.2RT-PCR

Trizol一步法提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR，检测SERPINA1的mRNA相对表达量。SERPINA1上游引物：5′-GGA ACA GGC TCA GGA CTA TCT C-3′，下游引物：5′-CAA CAT CTG GCA CTC CAC A-3′；GAPDH上游引物：5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′，下游引物：5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。以GAPDH基因作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

1.3.3Western blot

将组织和转染48 h后的肝癌细胞用细胞裂解法提取细胞总蛋白，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。样品均定量为5 μg/μL，变性，取50 μg蛋白经8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，70 V 100 min 电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入SERPINA1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9和β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加入相应二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST清洗后，Bio-Rad ChemiDocTMXRS+ System曝光显影，Bio-rad Quantity One软件扫描胶片的灰度值进行定量分析。

1.3.4免疫组织化学检测

组织标本用石蜡包埋，切成厚度为4 μm的薄片，采用免疫组织化学法检测SERPINA1表达，染色结果以细胞胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒判断为阳性。免疫组织化学检测结果采用Greenspan分级，根据阳性细胞数和染色强度进行综合评分。每张切片在光镜下随机挑选10个400倍视野，每个视野计数100个细胞。染色信号的强度分为4级：0级为“-”，1级为“+”，2级为“++”，3级为“+++”。阳性信号的面积根据阳性区域占整体切片面积的百分比分为5级：0级为0，1级为>0～25%，2级为>25%～50%，3级为>50%～75%，4级为>75%～100%。Greenspan分级将信号面积得分与信号强度得分相乘，“-”为0分；“+”为1～4分；“++”为5～8分；“+++”为9～12分。评分过程由两位不知晓样本临床资料的实验人员独立完成。Greenspan分级“-”和“+”的样本为低表达组，Greenspan分级“++”和“+++”的样本为高表达组。

1.3.5Transwell实验

取人工基底膜和无血清培养基按1∶4混匀加入Transwell小室中，凝固。无血清培养基饥饿培养24 h的HepG2细胞，无血清培养基清洗3次，将细胞悬液的细胞浓度调节为1×106/mL，每个Transwell小室下室加入500 μL含10% FBS的培养基，上室加入200 μL细胞悬液，37 ℃培养箱培养48 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色5 min，PBS洗2次，用棉签擦去Transwell小室上表面细胞，显微镜下观察并计数。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 随访结果

78例肝癌患者男58例，女20例；年龄31～79岁，≤50岁46例，>50岁32例；28例术前甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L,50例AFP>400 μg/L；34例肿瘤直径>5.0 cm，44例肿瘤直径≤5.0 cm；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期44例；病理分级Ⅰ、Ⅱ级33例，Ⅲ、Ⅳ级45例；肿瘤有包膜28例，无包膜50例；血管侵犯34例，无血管侵犯44例；肿瘤单发42例，多发36例。所有研究病例均获随访，随访截至2021年2月。78例行手术切除的肝癌患者随访时间2～72个月，中位随访时间28个月，5年总累积生存率17.9%(14例)。随访期间共有41例复发，复发率为52.6%。复发时间为术后2～49个月，复发中位时间为术后15个月。复发转移部位依次为肝28例、肺24例、腹腔3例、骨7例、腹膜2例、脑2例、胸膜2例、胰1例、纵隔1例、食管1例。

2.2 患者肝癌组织和癌旁组织中SERPINA1 mRNA和蛋白表达比较

肝癌组织中SERPINA1 mRNA表达明显高于癌旁组织[(1.396±0.059)vs.(1.103±0.053)，t=4.872,P<0.05]，SERPINA1蛋白表达亦明显高于癌旁组织[(0.894±0.086)vs.(0.583±0.095)，t=5.811,P<0.01]，见图1。

2.3 SERPINA1表达与肝癌临床病理特征的关系

SERPINA1主要定位于细胞质，见图2。肝癌组织SERPINA1的阳性表达率为60.3%(47/78)，癌旁组织为42.3%(33/78)，比较差异有统计学意义(χ2=5.03，P<0.05)。肝癌组织中SERPINA1阳性表达与TNM分期、病理分级和血管侵犯有关(P<0.05)，见表1。

图2 肝癌组织SERPINA1免疫组化结果(×100)

表1 肝癌组织SERPINA1表达与临床病理特征的关系

2.4 SERPINA1表达与肝癌患者预后的关系

78例肝癌患者术后1、3、5年累积复发率分别为23.1%(18/78)、46.2%(36/78)、48.7%(38/78)，术后1、3、5年累积生存率分别为83.3%(65/78)、42.3%(33/78)、17.9%(14/78)，见表2。SERPINA1高表达组5年累积复发率明显高于SERPINA1低表达组(χ2=7.305，P<0.01)，5年累积生存率低于SERPINA1低表达组(χ2=5.899，P<0.05)，见图3。

表2 肝癌患者术后1、3、5年累积复发及生存情况比较

A：累积复发率；B:累积生存率。

2.5 SERPINA1表达对肝癌细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，siSERPINA1组穿过小室基底膜的细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，Mock组无明显差异(P>0.05)，见图4。

图4 各组细胞侵袭能力的变化

2.6 SERPINA1表达对肝癌细胞上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的影响

与对照组和Mock组比较，siSERPINA1组E-cadherin表达上调，SERPINA1、MMP-9和N-cadherin表达下调，差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

图5 各组EMT相关蛋白表达比较

3 讨 论

SERPINA1是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的主要成员，主要由肝细胞合成，少部分由巨噬细胞和单核细胞产生[7]。在人类基因组中，SERPINA1定位于第14号染色体上的q32.1,长度约为370 kb[8]。SERPINA1具有强烈的催化反应活性，能够与酶的活性部位结合，抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶，在调节酶活性和蛋白质代谢等方面发挥重要的作用[9]。除此之外，SERPINA1还参与了生物体内多种生理和病理反应，在调节细胞生长、细胞分化、细胞运动和信号转导中发挥作用[4]。

鉴于其重要的生物学功能，SERPINA1已经引起研究者的关注，并已成为肿瘤研究领域的热点[10]。ERCETIN等[11]研究发现，SERPINA1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且癌组织中SERPINA1表达越高，患者的生存率越低。KWON等[12]研究发现，直结肠癌中SERPINA1表达与患者肿瘤分期、淋巴结转移和预后不良相关，过表达SERPINA1增强直结肠癌细胞株侵袭和迁移的潜能，反之，沉默SERPINA1表达抑制直结肠癌细胞株的侵袭和迁移的潜能，进一步研究发现SERPINA1通过与Snail结合参与调节直结肠癌的侵袭转移。在胃癌中，JIANG等[4]研究表明SERPINA1表达与胃癌的进展有关，SERPINA1可能是预防胃癌侵袭和转移的潜在靶标。本研究采用RT-PCR和Western blot检测肝癌组织和癌旁组织中SERPINA1 mRNA和蛋白表达，结果显示肝癌组织中SERPINA1表达明显高于癌旁组织，SERPINA1表达与肝癌病理分级、TNM分期和血管侵犯相关(P<0.05)，而与肝癌其他临床病理学参数无关(P>0.05)，提示SERPINA1表达可能在肝癌侵袭转移中发挥着重要的作用。

本研究采用Kaplan-Meier生存曲线分析SERPINA1表达与肝癌患者术后预后的关系，结果显示SERPINA1高表达组患者5年累积生存率明显低于SERPINA1低表达组(χ2=5.899，P<0.05)，5年累积复发率明显高于SERPINA1低表达组(χ2=7.305，P<0.01)，表明肝癌组织SERPINA1高表达的患者可能具有更高的复发和转移的风险。为了进一步研究SERPINA1表达与肝癌细胞侵袭迁移的关系，采用RNA干扰技术在肝癌HepG2细胞中干扰SERPINA1的表达，然后应用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力，结果显示与对照组和Mock组比较，siSERPINA1组穿过Transwell小室基底膜的细胞数量明显减少，表明沉默SERPINA1的表达可以抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，SERPINA1与肝癌细胞侵袭迁移密切相关，与KWON等[12]研究结果一致。

EMT是指上皮细胞发生成纤维细胞形态改变，转化为具有间质细胞表型的生物学过程,是胚胎发育和器官形成的基础过程[13]。大量研究结果表明，EMT在肿瘤的侵袭转移过程中也发挥着至关重要的作用，它是上皮源性肿瘤细胞转移的关键步骤[14]。EMT程序启动后，肿瘤细胞的上皮表型向间质表型转变，主要表现为上皮细胞失去细胞间黏附和细胞极性等分化表型，获得侵袭迁移和抗凋亡等间质细胞特征，同时间质细胞和上皮细胞标志物表达发生改变，如上皮标志物E-cadherin表达下调，间质标志物N-cadherin表达上调等[15]。MMPs的重要作用是降解细胞外基质，通过影响细胞外基质导致EMT，促进肿瘤细胞移动。MMP-9已被证实在不同类型的肿瘤中促进肿瘤发生、发展，并且与肿瘤的侵袭和不良预后相关[16-17]。本研究发现，上皮标志物E-cadherin表达升高，而MMP-9和间质标志物N-cadherin表达下降，表明SERPINA1可能通过调控MMP-9和EMT相关蛋白的表达，进而影响肝癌细胞的侵袭迁移。

综上所述，SERPINA1在肝细胞癌中高表达，并与患者预后相关；SERPINA1可能通过调控MMP-9表达和肝癌细胞EMT，进而影响肝癌细胞的侵袭迁移。SERPINA1可能是预防肝癌迁移和早期干预的新的标志物。