抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜形成的乳杆菌筛选及机制初探

李佳珣, 叶雨寒, 胡心怡, 张秋香, 赵建新

(江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122)

近年来,慢性创面感染的发病率不断上升,伤口愈合缓慢影响了患者的生活质量[1-2]。慢性创面感染主要受多种微生物的影响,这些微生物定植在伤口上形成生物膜,并产生代谢产物进而延缓伤口的愈合[3-4],其中最常见的病原菌为铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌[5],二者具有协同作用共同形成毒力和抗生素耐受性更强的生物膜[6]。生物膜态病原菌对大部分慢性创面感染有实质性的影响,进而导致伤口愈合不良[7]。病原菌生物膜的形成与群体感应系统的调控密不可分[8],其中,铜绿假单胞菌群体感应系统中的lasR和rhlI基因[9-10]和金黄色葡萄球菌群体感应系统中的SarA和RNAIII基因[11-12]与生物膜形成和致病菌的毒力因子表达密切相关。随着对益生菌研究的不断深入,在皮肤健康领域应用益生菌疗法已有一些研究和尝试,如植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌[13-14]。Onbas等[15]研究发现植物乳杆菌F10上清液对皮肤慢性创面致病菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用。Moreira等[16]研究表明,小鼠口服鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724可以促进皮肤伤口愈合并减少疤痕形成。然而目前的研究主要集中在乳杆菌对单菌感染的抑制效果评价上,乳杆菌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌混合生物膜形成及其种间群体感应的影响鲜有报道。本研究通过探究乳杆菌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群体感应信号分子AI-2的产量等指标综合评价乳杆菌的抗感染潜力,采用PCA等分析方法筛选得到具有优良特性的益生菌菌株,最后评价其对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜和群体感应系统相关基因的影响,以期得到具有抗感染潜力的乳杆菌,为其应用于慢性创面敷料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM233(分离自昂立一号口服液)、CCFM595(分离自四川眉山泡菜)、CCFM11(分离自发酵蔬菜)、CCFM10(分离自发酵蔬菜)、CCFM634(分离自四川内江泡菜)、CCFM8724(分离自发酵蔬菜)、CCFM361(分离自土壤)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)FHBZX 13M4、FHNFQ 15L11、FCQJJ 9M2(均分离自粪便)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM(分离自商业化酸奶发酵剂)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)FAHWH 30-1、FAHWH 26-1、FBJCY 3-1、FBJCY 2-1(均分离自粪便)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)D-6-A122、D-9-A28(均分离自酸奶)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)17312(分离自重庆泡菜水),上述乳杆菌现保藏于江南大学食品生物技术中心;哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)BB170由渤海大学食品科学与工程学院励建荣教授课题组惠赠,现保藏于江南大学食品生物技术中心;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC1.1861、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC29213购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,现保藏于江南大学食品生物技术中心。

1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化钠 10.0 g,蒸馏水1.0 L,配制固体培养基时添加20 g琼脂,用于培养生物膜的LB培养基则需添加0.1 g蔗糖;MRS培养基：葡萄糖20.0 g,牛肉膏10.0 g,胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,无水乙酸钠5.0 g,柠檬酸氢二铵2.0 g,磷酸氢二钾2.0 g,硫酸镁0.58 g,硫酸锰0.25 g,吐温-80 1.0 mL,蒸馏水1.0 L,pH调至6.2～6.4。以上培养基均115 ℃高压灭菌20 min;AB培养基：氯化钠0.3 mol,硫酸镁 0.05 mol,酸水解酪蛋白 0.2 g,蒸馏水1.0 L,115 ℃ 高压灭菌20 min后加入10 mL 1 mol/L的无菌磷酸钾缓冲液,10 mL 0.1 mol/L的无菌精氨酸溶液和20 mL 50%(体积分数)无菌甘油;2216E培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 结晶紫、甲醇、冰醋酸、三氯甲烷、异丙烷、无水乙醇、胰蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、牛肉膏、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温-80、精氨酸、甘油、蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司,酵母提取物购自赛默飞世尔科技有限公司,酸水解酪蛋白购自上海碧迪医疗器械有限公司,RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司,全波长酶标仪(Multiscan Go,赛默飞世尔科技有限公司);实时荧光定量PCR仪(CFX96, 上海伯乐生命医学产品有限公司);台式冷冻高速离心机(Centrifuge 5424R,Eppendorf公司);基因扩增仪(T100,上海伯乐生命医学产品有限公司);微量核酸检测仪(NanoPhotometer®N120,德国因普恩中国有限公司)。康宁96孔细胞培养板购自南通市海之星实验器材有限公司,qPCR 96孔板、premix Mix购自上海伯乐生命医学产品有限公司,无酶枪头购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养 取出-80 ℃保藏的乳杆菌,将菌液以体积比1∶50分别接种于5 mL的MRS培养基中,于微需氧恒温培养箱中37 ℃静置培养18 h。将金黄色葡萄球菌CGMCC1.1861、铜绿假单胞菌ATCC29213接种于LB培养基中,于需氧振荡培养箱中37 ℃培养18 h。哈维氏弧菌BB170接种于2216E培养基,于需氧振荡培养箱中28 ℃,200 r/min 培养18 h。活化3代后用于实验。为培养双菌生物膜,将活化后的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌接种于0.1 g/L(质量浓度)蔗糖的LB液体培养基中,使菌悬液浓度达到约107cfu/mL。为得到乳杆菌无菌上清液,将乳杆菌的过夜培养液于4 ℃以6 000×g离心10 min,为排除酸的影响,取一半上清液调pH至中性(pH=7),用0.22 μm的滤膜过滤除菌,另一半上清液直接过滤除菌,置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 结晶紫法测定致病菌生物膜量 采用结晶紫染色法,在96孔板中分别加入金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液各75 μL,随后将乳杆菌上清液加入孔板中,37 ℃静置培养24 h。阴性对照组以同等体积的MRS培养基代替。培养结束后去除培养液,用1 mol/L的磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline, PBS)小心清洗生物膜2遍,室温静置晾干。向每孔中加入100 μL甲醇以固定生物膜,10 min后弃去甲醇,自然晾干,加入100 μL 0.1%(质量分数)的结晶紫溶液,将生物被膜染色30 min。染色结束后用PBS清洗2遍,每孔以100 μL 33%(体积分数)的冰醋酸溶解,用酶标仪读取OD600吸光度值。每组设置6个平行[17]。

1.2.3 抑菌圈法测定乳杆菌对致病菌生长的抑制作用 为筛选得到不抑制铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌生长但能够显著抑制致病菌生物膜形成的乳杆菌,采用双层平板打孔法,在素琼脂上倒一层LB固体培养基,在其上涂布铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌,随后在琼脂上打孔并在孔内分别加入200 μL已调pH的乳杆菌上清液和未调pH的乳杆菌上清液,37 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈直径。每组设置2个平行。

1.2.4 化学发光法测定AI-2信号分子 哈维氏弧菌发光现象受到群体感应的调控,其中哈维氏弧菌BB170菌株仅识别AI-2信号分子从而发光,发光强度随AI-2分子的含量升高而增大。为探究乳杆菌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌群体感应系统的影响,本研究采用哈维氏弧菌BB170化学发光法检测乳杆菌自身产生AI-2能力以及乳杆菌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之间AI-2的影响,按1.2.2所述培养生物膜,培养结束后收集、过滤获得双菌培养的无菌上清液,备用。活化后的哈维氏弧菌BB170接种于AB培养基,28 ℃、180 r/min培养12 h,调节菌液OD600为0.8左右,再用无菌新鲜AB培养基按1∶2 000(体积比)稀释该菌液,混匀备用。按1∶50(体积比)将乳杆菌上清液或上述收集的双菌培养上清液与哈维氏弧菌BB170稀释菌悬液混合。28 ℃、100 r/min培养5 h,避光条件下吸取200 μL于黑色不透明酶标板中,以多功能酶标仪于波长571 nm处检测哈维氏弧菌BB170化学发光情况[18]。

1.2.5 RT-qPCR测定致病菌毒力基因表达 按1.2.2制备生物膜样品,用生理盐水洗脱生物膜并移至无酶离心管中,4 ℃、3 000×g离心2 min,弃上清液,按RNA提取试剂盒提取生物膜RNA,提取后于微量核酸检测仪测定RNA浓度。随后用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。RT-qPCR所用引物如表1所示。反应体系为10 μL：SYBR Green Mix 5 μL;上下游引物各0.5 μL;cDNA 1 μL;无酶ddH2O 3 μL。反应条件为95 ℃ 15 min、40个循环(95 ℃ 15 s 55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)、融解曲线(95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃ 0.5 s)。以16S rRNA作为内参基因校准相关基因的相对mRNA水平,通过2-ΔΔCt法对靶基因进行定量分析[19]。

表1 RT-qPCR所用引物

1.2.6 数据分析和处理 数据分析使用Graphpad Prism 8.4.3、R studio 4.0.1、SPSS软件,使用One-way anova进行方差分析,P< 0.05表示具有显著性差异,使用Graphpad Prism 8.4.3、R包 ggplot2和PCAtools等进行数据可视化。

2 结果与分析

2.1 乳杆菌对致病菌生物膜量的影响

生物膜对超过90%的慢性创面感染有实质性的影响，会导致伤口愈合不良。由图1可知，未调pH的乳杆菌上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌双菌生物膜的形成均具有显著的抑制作用，这可能是由于乳杆菌上清液中的酸抑制了双菌生物膜的形成[24]。而大部分调pH后的乳杆菌上清液没有抑制生物膜的效果。由图1B可知，植物乳杆菌CCFM233、CCFM595，卷曲乳杆菌13M4、15L11、9M2，嗜酸乳杆菌NCFM显著抑制生物膜的形成，而鼠李糖乳杆菌FAHWH26-1显著促进生物膜的形成。

图1 乳杆菌上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌双菌生物膜抑制效果评价Fig.1 Evaluation of the biofilm inhibitory effect of Lactobacillus supernatant on biofilms ofPseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureusA：未调pH;B：调pH。*表示与对照组差异显著(P<0.05)A： Without pH adjustment; B： pH adjustment. * Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.2 乳杆菌对致病菌生长的影响

未调pH的乳杆菌上清液显著抑制生物膜的形成,而大部分调pH后的乳杆菌上清液没有抑制生物膜形成的效果,这可能是由于调pH和未调pH的乳杆菌上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生长能力的影响不同,因此采用抑菌圈法测定乳杆菌上清液作用于致病菌后抑菌圈直径,结果表明(表2),除卷曲乳杆菌15L11、鼠李糖乳杆菌A28、短乳杆菌17312外,其余未调pH的乳杆菌上清液对两种致病菌都具有不同程度的抑菌能力,其中植物乳杆菌CCFM233对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均有较大的抑菌圈。而调pH的乳杆菌上清液均不能抑制菌的生长,因此,调pH的乳杆菌上清液可能通过群体感应等其他方式来调控生物膜形成。后续仅对调pH的乳杆菌上清液进行研究。

表2 未调pH的乳杆菌上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果评价Table 2 Evaluation of the bacteriostatic effect of Lactobacillus supernatant without pH adjustment on P. aeruginosa and S. aureus

2.3 乳杆菌对细菌间群体感应信号分子AI-2产生的影响

为探究乳杆菌对致病菌群体感应的影响,使用哈氏弧菌生物发光法测定乳杆菌自身AI-2产量和其对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之间AI-2的影响,由图2A可知,乳杆菌菌株自身产生的AI-2 信号分子有所差异,其中,植物乳杆菌CCFM233、CCFM11、CCFM10,鼠李糖乳杆菌FBJCY 3-1,短乳杆菌17312产生的AI-2分子较多。乳杆菌的AI-2的产生与其抗菌能力如细菌素分泌密切相关,AI-2产量越多,其抗菌能力越强[25]。不同乳杆菌菌株对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之间AI-2分子的影响也不同,植物乳杆菌CCFM233和CCFM634干预后,种间的AI-2显著升高,但植物乳杆菌CCFM233能显著抑制生物膜的形成,而植物乳杆菌CCFM634则不能,这可能是由于本身AI-2分子的含量差异所导致。

图2 群体感应评价Fig.2 Evaluation of quorum sensingA：乳杆菌自身产生AI-2产量;B：乳杆菌上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之间群体感应分子AI-2产生的影响。*表示与对照组差异显著(P<0.05)A： AI-2 production by Lactobacillus; B： Effect of Lactobacillus supernatant on the production of AI-2, a quorum-sensing molecule between P. aeruginosa and S. aureus. *Iindicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.4 乳杆菌特性综合分析

为筛选得到具有抗感染潜力的乳杆菌菌株,采用主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)来评价乳杆菌抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的能力。载荷图(图3B)显示可以分为6个主成分,其中最重要的是第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2),其贡献率分别为50.9%和49%,其中PC1的特征是乳杆菌上清液调pH时对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的抑制效果,PC2的特征是乳杆菌自身AI-2产量和其对种间AI-2的影响。由图3A可知,PCA得分高的细菌为植物乳杆菌CCFM233和CCFM634,具有较高的综合能力。再结合热图(图3C)分析,热图颜色越接近红色,表示抑菌圈直径、致病菌生物膜形成量、AI-2产量越高,由此可见,植物乳杆菌CCFM233产生的AI-2信号分子较多,具有良好的抑菌能力,致病菌生物膜形成量最低,因此选择植物乳杆菌CCFM233做进一步研究。

2.5 植物乳杆菌CCFM233对致病菌毒力基因表达的影响

为探究植物乳杆菌CCFM233对致病菌群体感应调控毒力基因的影响,使用RT-qPCR测定CCFM233上清液干预后金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的毒力基因表达能力。铜绿假单胞菌QS受lasI/R系统控制,LasR的抑制可导致下游QS信号的丢失。由图4可知,在CCFM233干预后,LasR和rhlI分别下调了82%和18%,这两个基因的显著下调说明乳杆菌抑制了铜绿假单胞菌的毒力基因表达,进而抑制了生物膜形成。负责调控金黄色葡萄球菌生物膜形成和部分毒力因子表达的SarA基因在CCFM233上清液干预后显著下调(85%),说明了乳杆菌抑制了金黄色葡萄球菌毒力因子表达。而RNAIII的基因表达水平与对照组相近,没有显著下降。

图4 植物乳杆菌CCFM233上清液对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌基因表达的影响Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum CCFM233 supernatant on gene expression of P. aeruginosa and S. aureus*表示与对照组差异显著(P<0.05)* Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

3 讨 论

皮肤的慢性创面存在着生物膜态的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性细菌,其能够在医疗设备和人体组织中定殖引起感染,并在临床环境中会形成耐抗生素生物膜[26]。金黄色葡萄球菌是一种革兰阳性细菌,会分泌多种外毒素,如肠毒素、白细胞溶血素等,且会在医院使用的各种医疗设备表面形成生物膜,导致慢性和持续性感染[27]。近年来乳杆菌在皮肤健康方面应用广泛,Ong等[28]研究表明植物乳杆菌USM8613可以产生植物乳杆菌素,并抑制伤口部位的金黄色葡萄球菌感染进而促进伤口愈合,Vagesjo等[29]研究发现罗伊氏乳杆菌产生CXCL12加速小鼠伤口愈合,Fang等[30]研究发现植物乳杆菌CCFM8610改善了特应性皮炎。本研究通过评价实验室保存的乳杆菌菌株对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群体感应信号分子AI-2产量的影响,发现同种不同株的乳杆菌抑制生物膜形成的能力也有所差异。值得注意的是,未调pH的乳杆菌上清液对两种致病菌都具有不同程度的抑菌能力,而调pH的乳杆菌上清液均不能抑制细菌的生长,说明调pH的乳杆菌上清液可能通过其他方式调控生物膜形成,比如调节群体感应。研究结果进一步证实了植物乳杆菌CCFM233显著抑制生物膜的形成,且种间的AI-2显著升高,李建周等[25]的研究结果表明乳杆菌通过提高铜绿假单胞菌AI-2的表达进而抑制其形成生物膜,本研究也与该研究结果一致。

随后采用PCA等分析方法筛选得到一株益生菌菌株植物乳杆菌CCFM233,该菌株具有优良特性和抗感染潜力,自身产生的AI-2产量高且可以显著抑制致病菌生物膜形成,提高致病菌间的AI-2产量。最后评价植物乳杆菌CCFM233对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜和群体感应系统相关基因的影响,其显著下调了铜绿假单胞菌的LasR和rhlI以及金黄色葡萄球菌的SarA,但RNAIII的基因表达水平与对照组相近,这可能因为金黄色葡萄球菌的QS系统agr可感知环肽信号分子的局部浓度,并将其转化为特定的基因表达模式[31],因此RNAIII作为agr系统的主要效应器,在CCFM233上清液干预后,金黄色葡萄球菌的环肽信号分子浓度有所上升,故RNAIII的基因表达水平没有显著下降。

综上,本研究揭示了植物乳杆菌CCFM233具有抗铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染的潜力,为其应用于慢性创面敷料及相关生物制品的研发提供了一定的理论依据,乳杆菌自身产生AI-2以及乳杆菌在致病菌生物膜环境中产生AI-2的能力与其抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌形成生物膜的量效关系仍有待进一步研究。