麒麟丸对卵巢颗粒细胞损伤的修复作用研究

刘佳，罗丽，谢成松，邓高丕

（1.广东食品药品职业学院，广东广州510520；2.广州市荔湾区中医医院，广东广州510150；3.广东太安堂药业股份有限公司，广东汕头515021；4.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

卵巢颗粒细胞形态学变化和功能分化伴随着卵泡生长发育全过程，卵巢储备功能下降（DOR）的发生建立在卵巢颗粒细胞损伤的病理基础上，引起促卵泡生成激素（FSH）、孕酮（P）及雌二醇（E2）的合成分泌异常[1-3]。麒麟丸由制何首乌、墨旱莲、淫羊藿、菟丝子、锁阳、党参、郁金、枸杞子、覆盆子、山药、丹参、黄芪、白芍、青皮、桑椹组成，具有补肾填精、益气养血的功效，适用于男子不育症和女子不孕症等疾病。既往临床研究表明，麒麟丸可有效治疗DOR和黄体功能不全，能显著调节促卵泡激素受体（FSHR）及E2的合成分泌，刺激孕酮（P）分泌，促进子宫内膜增厚，且疗效优于黄体酮治疗[4-7]，提示麒麟丸与恢复卵巢颗粒细胞正常形态和功能有关。基于此，本研究在细胞水平上进一步探讨麒麟丸治疗DOR，改善受损卵巢颗粒细胞可能的作用机制，以期丰富麒麟丸临床作用内涵，为挖掘麒麟丸更多的适应症提供参考。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株人卵巢颗粒细胞KGN，购自广州市欣福联生物科技有限公司。以含10%血清的KGN专用培养液置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每48 h换1次新鲜培养液。

1.2 药物麒麟丸，由广东太安堂药业股份有限公司生产，批号：国药准字Z10930034。麒麟丸水提物制备：取麒麟丸溶于水，5 000×g离心15 min去沉淀，冷冻干燥获得冻干粉，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中。

1.3 试剂与仪器KGN细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DSMO）（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗抗苗勒激素（AMH）抗体（京博奥森生物技术有限公司）；兔抗Smad2/3抗体（南京巴傲得生物科技有限公司）；兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（美国Abcam公司）；E2酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（武汉艾博泰克生物有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（江苏凯基生物公司）；增强化学发光液（ECL）（美国Bio-Rad公司）。Multiskan SkyHig全波长酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；垂直电泳仪及转移系统（美国Bio-Rad公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

1.4 麒麟丸对正常培养人KGN细胞活性的影响根据前期预实验结果，当麒麟丸水提物剂量高于10 mg·L-1时，对KGN细胞正常增殖产生了明显的抑制作用，故以此剂量为上限设置3个剂量等级（2.5、5、10 mg·L-1）。实验设置正常对照组（正常培养液培养），麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组等4组。取处于对数生长期KGN细胞，采用胰酶常规消化，接种至96孔板，细胞密度为2×105个/孔，每组设6个复孔。培养48、72 h后，每个孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，4 h后去掉培养液，加入DMSO工作液，震荡5 min，应用酶标仪于570 nm波长处检测吸光度（OD）值。

1.5 雷公藤多苷诱导人KGN细胞损伤模型建立参考文献研究[8]，应用雷公藤多苷诱导建立人KGN细胞损伤模型。实验设置正常对照组（正常培养液培养），雷公藤多苷125、100、80 μg·mL-1组等4组。取处于对数生长期KGN细胞，用胰酶常规消化，接种至96孔板，细胞密度为2×105个/孔，每组设6个复孔。培养48 h后，采用MTT法检测各组细胞活性，检测步骤同“1.4”项。

1.6 麒麟丸对雷公藤多苷致人KGN细胞损伤模型活性的影响实验分为正常对照组，模型组，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组等5组。取处于对数生长期KGN细胞，用胰酶常规消化，接种至96孔板，细胞密度为2×105个/孔，每组6个复孔。正常对照组以正常培养液培养，模型组以含雷公藤多苷125 μg·mL-1的培养液培养，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组在含有雷公藤多苷125 μg·mL-1培养液中分别对应加入2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸水提物。培养48 h后，采用MTT法测定各组细胞活性。

1.7 采用Western Blot法观察麒麟丸对雷公藤多苷致人KGN细胞损伤模型AMH、Smad2、Smad3蛋白表达的影响按“1.6”项分组，取干预48 h后的KGN细胞，加预冷的裂解液，于冰浴中反复用1 mL移液器吹打裂解。BCA法测定蛋白浓度，将蛋白调整至统一浓度后，加入5×上样缓冲液，沸水浴10 min使蛋白变性后电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h，Tris盐-Tween-20缓冲液（TBST）洗膜后分别加入按体积比稀释的GAPDH抗体（1∶1 000）、AMH（1∶500）、Smad2/3（1∶500）4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜，加入HRP山羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1 h，TBST洗膜，于ECL发光液显影。采用ImageJ软件识别图像灰度，结果以目的蛋白/内参蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。

1.8 采用ELISA法观察麒麟丸对雷公藤多苷致人KGN细胞损伤模型E2的影响按“1.6”项分组，提取干预48 h后的KGN细胞上清液（1 000×g离心10 min），按照E2的ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.9 统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麒麟丸对正常培养KGN细胞活性的影响图1、图2结果显示：与正常对照组比较，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组干预48、72 h细胞活性均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明麒麟丸对KGN细胞增殖无明显的促进或抑制作用。

图1 麒麟丸干预48 h对KGN细胞活性的影响Figure 1 Effect of Qilin Pills intervention for 48 hours on KGN cell activity

图2 麒麟丸干预72 h对KGN细胞活性的影响Figure 2 Effect of Qilin Pills intervention for 72 hours on KGN cell activity

2.2 雷公藤多苷诱导KGN细胞损伤模型建立图3结果显示，与正常对照组比较，雷公藤多苷100、125 μg·mL-1组细胞活性下降（P＜0.05或P＜0.01），表明雷公藤多苷100、125 μg·mL-1诱导48 h对KGN细胞有明显的抑制作用，提示造模成功。雷公藤多苷125 μg·mL-1诱导48 h抑制作用差异更显著，故选择雷公藤多苷剂量为125 μg·mL-1诱导48 h进行后续研究。

图3 不同浓度雷公藤多苷诱导48 h对KGN细胞活性的影响（n=3，MTT法）Figure 3 Effect of different concentrations of tripterygium glycosides on the activity of KGN cells induced for 48 hours（n=3，MTT method）

2.3 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型活性的影响图4结果显示：与正常对照组比较，模型组细胞活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组细胞活性均显著升高（P＜0.01）。表明麒麟丸可促进雷公藤多苷致KGN细胞损伤的修复。

图4 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型活性的影响（n=3，MTT法）Figure 4 Effect of Qilin Pills on the activity of KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides（n=3，MTT method）

2.4 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型AMH、Smad2、Smad3蛋白表达的影响图5～图8结果显示：与正常对照组比较，模型组细胞AMH、Smad2、Smad3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组AMH蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），麒麟丸2.5 mg·L-1组Smad2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组Smad3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。表明麒麟丸可逆转雷公藤多苷致KGN细胞损伤AMH、Smad2/3蛋白表达的降低。

图5 各组AMH、Smad2、Smad3蛋白电泳图Figure 5 Electrophoretogram of AMH，Smad2 and Smad3 proteins in each group

图8 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型Smad3蛋白表达的影响Figure 8 Effect of Qilin Pills on Smad3 protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

图6 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型AMH蛋白表达的影响Figure 6 Effect of Qilin Pills on AMH protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

图7 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型Smad2蛋白表达的影响Figure 7 Effect of Qilin Pills on Smad2 protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

2.5 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型E2水平的影响图9结果显示：与正常对照组比较，模型组E2水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1组E2水平显著升高（P＜0.01）。表明麒麟丸能促进雷公藤多苷致损伤的KGN细胞E2的分泌。

图9 麒麟丸对雷公藤多苷致KGN细胞损伤模型雌二醇（E2）水平的影响Figure 9 Effect of Qilin Pills on E2 level in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

3 讨论

卵巢储备功能是指卵巢皮质区卵泡生长、发育形成可受精的卵母细胞的能力。卵巢卵泡池中卵子数目减少或是质量下降导致女性生育能力下降及雌孕激素的缺乏，即为卵巢储备功能下降（DOR）[9-10]。卵子由卵巢中的卵泡产生，初级卵母细胞由卵巢中单层颗粒细胞包被形成原始卵泡，而后形成由多层颗粒细胞包被的成熟卵泡，同时颗粒细胞由扁平细胞分化为立方或者柱状上皮细胞，并逐步表达促卵泡激素受体（FSHR），调节抗苗勒管激素（AMH）和雌二醇（E2）等激素的分泌。故以上各激素分泌水平常用来评价卵巢储备功能。

卵巢颗粒细胞KGN分离自卵巢组织，是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长、启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动。KGN细胞是卵泡内的最大细胞群，卵泡发育的显著标志之一就是卵巢颗粒细胞迅速生长及增殖。本研究对正常的KGN细胞给予麒麟丸干预，发现在48 h和72 h干预过程中，2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸均未对其增殖产生明显影响，这表明麒麟丸对KGN细胞的增殖无明显刺激或抑制作用，使其正常增殖，而并非激化其肆意增殖。采用80、100、125 μg·mL-1雷公藤多苷诱导KGN细胞48 h，发现其抑制作用呈量效趋势，认为剂量为125 μg·mL-1更适合KGN细胞损伤模型的构建。然后，在此细胞损伤模型基础上给予2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸干预，发现干预48 h时，3个剂量的麒麟丸均能够显著逆转雷公藤多苷对KGN细胞增殖的抑制作用，使之增殖活性接近于正常水平，并呈一定的量效趋势，表明麒麟丸对受损KGN细胞增殖活性具有保护作用。

除了对KGN细胞宏观生长增殖进行观察，本研究还检测了能够反映KGN细胞功能的AMH和E2指标。AMH主要由次级卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡颗粒细胞分泌，调节卵泡的生长发育，不受促性腺激素等药物的调节，可早期准确评估卵巢储备功能，是公认的预测价值最大的生物标志物。E2的产生受到卵巢颗粒细胞分泌抑制素B（INHB）的调控，是预测卵巢储备功能的指标[11]。通过检测AMH和E2水平，可了解受损KGN细胞功能的恢复情况。本研究结果发现，雷公藤多苷诱导可明显抑制KGN细胞AMH蛋白表达，2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸均能够逆转此抑制作用，且呈现明显的量效促进作用。其中，10 mg·L-1麒麟丸不但能够逆转雷公藤多苷诱导对KGN细胞活性的抑制作用，与正常的KGN细胞组比较还具有明显的促进KGN细胞AMH蛋白表达的作用，而与相同剂量麒麟丸对受损KGN细胞增殖促进作用的结果进行横向比较，其对AMH蛋白表达的促进作用更为显著。这说明，10 mg·L-1的麒麟丸虽然在一定程度上促进了KGN细胞增殖，但是在细胞功能上已经产生了相对突出地促进AMH表达的作用，这也佐证了AMH在一定程度上具有抑制KGN细胞过度增殖的作用。

本研究通过观察麒麟丸对受损KGN细胞E2分泌的调节作用，结果发现，麒麟丸能够逆转雷公藤多苷对KGN细胞E2分泌的抑制作用，使之恢复正常水平，此作用结果与其对受损KGN细胞增殖的修复结果相符。提示麒麟丸可改善受损KGN细胞E2的异常分泌，具有保护卵巢储备功能的作用。

DOR发生的病理基础存在KGN细胞的形态及功能异常。在卵泡发育初期，主要以KGN细胞形态学的变化为主，形成初级卵泡后，KGN细胞的功能也出现了分化，逐渐能够表达FSHR等，并开始合成分泌雌激素。可见，KGN细胞的形态学和功能的分化是卵泡生长发育的基础。有研究[12-13]表明，Smads信号通路是调控卵泡发育的重要途径，对卵泡的生长发育有调控作用。Smad蛋白家族使转化生长因子βⅠ型受体（TGF-βRⅠ）磷酸化，继而激活Smad2、Smad3使其磷酸化，正向调控细胞膜至核的信号传导。本研究结果表明，麒麟丸干预能够促进受损KGN细胞中受到抑制的Smad2和Smad3蛋白表达，并与指标E2和AMH结果一致。

综上所述，麒麟丸能够在细胞水平上表现出很好地促进受损卵巢颗粒细胞修复和功能恢复的作用，麒麟丸改善DOR的机制可能是经由Smads信号通路调控Smad2、Smad3蛋白表达，进一步促进雌激素的分泌。