电针改善缺血性卒中模型小鼠认知障碍的作用机制研究

2023-02-03潘友灿刘彦宜尹雷孙健

广州中医药大学学报 2023年1期

潘友灿，刘彦宜，尹雷，孙健

（1.广东省中医院芳村医院传统疗法科，广东广州510380；2.广州中医药大学期刊中心，广东广州510006；3.广东省中医院脑病六科，广东广州 510120）

目前，卒中（cerebral stroke，CS）已成为主要的全球性公共卫生问题。2020年发布的《中国卒中报告》显示：我国卒中患病率为1 114.8/10万，死亡率为149.49/10万[1]。在全球范围内，我国已经成为卒中终身风险最高和疾病负担最重的国家[2]。卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中常见的并发症。近期大型国际队列研究报道，卒中幸存者10年内PSCI的患病率为61%[3]，而且卒中后认知功能障碍患者的死亡率明显高于无认知障碍患者，卒中后痴呆患者的5年生存率仅为39%，而同龄无痴呆症状的卒中患者生存率为75%[4]。因此，PSCI已成为影响我国经济社会发展的重大公共卫生健康问题和社会问题。在治疗方面，西医主要以多奈哌齐类胆碱酯酶抑制剂为主，但该类药物只能够短期改善临床症状，不能长期延缓病情的进展[5]。针灸治疗PSCI具有其独特的优势。“通督调神”针刺法是许能贵教授以百会、大椎穴为主穴，治疗缺血性中风及其并发症的治疗方案。本课题组前期临床试验证实，电针“百会”“大椎”穴可有效改善缺血性卒中患者认知障碍、延缓病程进展[6]。尽管该针刺方案治疗卒中后认知障碍临床疗效确切，但其机制尚不清楚，从而限制了其临床的推广与运用。因此，进一步探讨该方案治疗卒中后认知障碍的机制对本病的有效防治具有重要的临床意义。

大量研究发现，在缺血性卒中患者和模型动物的海马和丘脑等与认知功能密切相关的大脑结构中，出现β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积[7]。Aβ沉积导致神经元信号通路的破坏，从而影响神经元形态和功能，导致记忆和行为缺陷是学术界公认的卒中后认知障碍的重要原因[8]。有研究显示，针刺对实验动物脑组织中Aβ沉积及其前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）表达具有调节作用[9]。基于以上文献分析与前期试验结果，我们假设：电针百会、大椎穴可能通过抑制Aβ的沉积、减少神经元损伤，从而发挥改善认知障碍的作用。为了证实这一科学假设，本研究通过大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法诱导建立缺血性卒中动物模型，并观察电针百会、大椎穴对其学习记忆能力的影响，着重研究针刺对海马神经元保护和Aβ蛋白沉积的调控作用，探讨针刺治疗卒中后认知障碍的可能机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄健康雄性SPF级C57BL/6小鼠45只，由广州中医药大学动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK（粤）2013-0024，体质量21.3～22.6 g。所有实验程序严格按照中华人民共和国科技部实验动物使用指南执行。小鼠在食物充足、12 h暗/光循环的环境中饲养。

1.2 主要仪器与试剂

中研太和牌针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司产品，规格：0.2 mm×13 mm）；单丝缝合线（5-0 mm，美国Doccol公司）；6805-I型电针治疗仪（青岛鑫升实业有限公司提供）；新物体识别实验装置（上海欣软信息科技有限公司）；水迷宫实验装置（上海欣软信息科技有限公司）；冰冻切片机（英国赛默飞公司）。超敏ECL化学发光试剂盒（P0018，上海碧云天公司）；FD Rapid GolgiStain试剂（美国FD NeuroTechnologies公司，货号：PK401）；抗APP抗体（英国赛默飞公司，批号：512700）、抗Aβ抗体（美国Biolegend公司，批号：803017）；抗GRPDH抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：517400）。

1.3 分组与模型建立

将45只雄性C57BL/6小鼠随机选取33只进行造模，作为MCAO手术组，其余12只设为假手术组。按照Rousselet等[10]报道的使用MCAO方法诱导缺血性卒中模型：采用5%的异氟醚对小鼠进行深度麻醉后放置在保温垫上，体温维持在37℃，手术暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。结扎颈外动脉，然后将涂硅5-0单丝缝合线通过颈外动脉残端插入颈内动脉，在距插入点9～10 mm处栓塞大脑中动脉。MCAO 2 h后，拆线开始再灌注。假手术组小鼠在没有闭塞大脑中动脉的情况下接受相同的方案。小鼠苏醒后使用Longa评分评估MCAO模型是否成功建立[11]。造模过程中小鼠死亡8只，死亡率为24.2%（8/33），另有2只手术后未出现明显偏瘫，故剔除，造模成功率为69.7%（23/33）。造模成功小鼠被随机分为模型组11只、电针组12只。

1.4 电针方案

造模成功1周后，将小鼠固定在约束器中驯化1周，确保针刺过程中无挣扎以避免应激反应导致的实验误差。腧穴定位参考李忠仁主编的《实验针灸学》[12]常用实验动物针灸穴位。取百会、大椎穴，直刺2～3 mm，接通电针仪。电针参数根据我们前期实验经验[13]设置为：电流1～2 mA，频率4～20 Hz，强度以引起穴位周围组织轻微颤动为度。每日1次，每次20 min，连续15 d。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 新物体识别实验

在针刺治疗结束后第1天进行新物体识别实验，观察各组小鼠记忆形成能力。实验方法[14]如下：在熟悉阶段，将小鼠放置在装有两个完全相同物体的40 cm×40 cm的正方形盒子中10 min。10 min结束后，立即将小鼠放回原来饲养的鼠笼里，待小鼠休息1 h后进入测试阶段，其中一个物体被同一位置的新物体替换，每只小鼠探索该领域5 min。两次试验之间用75%乙醇彻底清洁盒子和物体以消除嗅觉线索。以小鼠前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体视为探索行为。实验过程中记录每只小鼠在熟悉和测试阶段探索对象所花费的时间。以探索新物体的时间和总探索时间的比值（认知指数）作为观察指标。

1.5.2 水迷宫实验

在针刺治疗完成后第2天进行水迷宫实验，观察各组小鼠对空间位置感和方向感的学习记忆能力。根据Gawel等[15]论述，该实验在一个直径80 cm、高31 cm的圆形水池中进行。水池中放入全脂牛奶因而水面不透明，水面下隐藏一直径5 cm、高14 cm逃生平台。水池被平均划分为东、西、南、北四个象限。首先，进行定位航行实验，将小鼠头朝池壁从任一象限放入水池中，记录小鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间（逃离潜伏期）。在前几次训练中，如果小鼠70 s内未找到隐藏平台，则引导小鼠至平台上并停留10 s。每只小鼠每天训练3次，每次训练间隔15～20 min，连续4 d。水迷宫实验第5天移除平台后进行空间探索实验，将小鼠由原平台象限的对侧放入水中，记录小鼠在70 s内穿越原平台的次数（平台穿越次数）和平台象限滞留时间占总时间的比例，以获得训练中逃离潜伏期和对位探查训练中平台穿越次数与平台象限滞留时间比为观察指标。

1.5.3 高尔基染色

在针刺治疗完成后第7天进行高尔基染色实验观察各组小鼠海马神经元形态，根据FD Rapid GolgiStain试剂盒说明书及本课题组前期实验经验[16]进行操作。小鼠深度麻醉后颈椎脱位处死，立即提取脑组织，采用0.9%氯化钠溶液冲洗后使用FD Rapid GolgiStain试剂盒中A液和B液1∶1混合溶液中避光浸渍2周，转移脑组织到C溶液保存48 h后在冰冻切片上切片。将切片放置在涂有明胶涂层的载玻片上，C液浸泡，室温中干燥、脱水后用二甲苯溶液洗脱，中性树胶封片。每组每只小鼠观察4个海马CA1区锥体神经元。在显微镜下，选择靠近切片中心的锥体细胞，在40倍镜下绘制在二维平面上。采用Sholl分析软件以神经元胞体为圆心画一系列同心圆，同心圆半径以20 μm逐渐扩大，得到离胞体距离变化的神经元树突与同心圆交点个数（交叉点数量）和树突分枝数量。以交叉点数量和树突分枝数量为观察指标。

1.5.4 蛋白质免疫印迹实验

根据蛋白质提取试剂盒说明提取小鼠海马蛋白质，常规配制浓缩胶和分离胶，蛋白加样，与电泳加样缓冲液混匀，分离等体积的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在5%脱脂牛奶中封闭1 h，然后加入一抗（Aβ所用浓度1∶1 000，APP所用浓度1∶800，GRPDH所用浓度1∶5 000）4℃孵育过夜。用含有Tween 20缓冲盐水冲洗膜3次，然后将膜与HRP偶联的二抗孵育2 h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色后，显影和定影拍照。重复3次实验，并使用ImageJ软件通过光密度分析确定蛋白质的定量。

1.6 统计学处理

运用SPSS 19.0软件对实验数据进行处理。首先对所有数据进行正态性检验、方差齐性检验，经检验所有数据均呈正态分布。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素重复测量方差分析或者双因素重复测量方差分析。当P＜0.05时定义差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠在新物体识别实验中偏好指数比较

为了验证电针百会、大椎是否能够改善缺血性卒中模型小鼠的认知功能，进行新物体识别实验，观察小鼠记忆形成能力差异。表1结果显示：在熟悉阶段，各组小鼠对相同物体的偏好指数差异无统计学意义（P＞0.05），排除了小鼠空间偏向对实验结果的影响。在实验阶段，模型组小鼠对新物体偏好指数显著减少，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠对新物体偏好指数显著增加，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组小鼠偏好指数比较Table 1 Comparison of the preference index among various groups of mice （±s，%）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组电针组鼠数/只12 11 12熟悉阶段51.16±12.84 50.42±6.83 48.92±10.19实验阶段70.25±7.97 55.42±11.08①66.25±11.02②

2.2 各组小鼠逃避潜伏期比较

为了进一步验证电针百会、大椎对缺血性卒中模型小鼠认知功能的改善作用，进行水迷宫实验，观察各组小鼠对空间位置感和方向感的学习记忆能力差异。表2结果显示：在定位航行实验中，模型组小鼠第3、4天逃避潜伏期延长，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠第4天逃避潜伏期缩短，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠逃避潜伏期比较Table 2 Comparison of the escape latency among various groups of mice （±s，s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组电针组鼠数/只12 11 12第1天66.17±3.43 65.58±2.84 66.67±2.90第2天54.58±9.74 61.67±9.59 57.33±6.17第3天43.00±14.51 56.92±9.89①47.42±11.84第4天30.58±8.35 46.92±10.75①32.25±10.66②

2.3 各组小鼠平台穿越次数和平台象限滞留时间比比较

表3结果显示：在空间探索实验中，模型组小鼠平台穿越次数和平台象限滞留时间比均显著减少，与假手术组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠平台穿越次数和平台象限滞留时间比均显著增加，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠平台穿越次数和平台象限滞留时间比比较Table 3 Comparison of the platform crossings times and plateau quadrant retention time ratios among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组电针组鼠数/只12 11 12平台穿越次数/次3.25±0.75 2.08±0.67①3.08±0.79②平台象限滞留时间比/%38.08±5.45 28.67±4.23①34.25±6.11②

2.4 各组小鼠海马CA 1区神经元形态比较

鉴于认知障碍和与神经元的病理性改变有关，我们利用Golgi staining观察各组小鼠神经元形态差异（如图1所示）。表4结果显示：模型组小鼠海马神经元树突与同心圆交叉点数量减少，与假手术组比较，模型组同心圆与胞体的距离为100、140、180 μm时，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠海马神经元树突与同心圆交叉点数量增加，与模型组比较，电针组同心圆与胞体的距离为100、140、180 μm时，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组小鼠神经元树突与同心圆交叉点数量比较Table 4 Comparison of the number of neuronal dendrites and concentric circle crossings among various groups of mice （±s，个）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组电针组鼠数/只12 11 12同心圆与胞体的距离/μm 20 2.66±1.37 2.50±1.31 3.00±1.76 60 10.50±2.11 8.67±1.67 9.58±1.98 100 13.58±1.88 10.00±2.30①13.50±1.88②140 15.25±1.82 10.00±1.75①14.91±2.27②180 12.42±2.78 6.50±3.71①11.83±2.16②200 7.00±4.02 3.50±3.55 6.00±2.04

图1 高尔基染色实验分析各组小鼠海马CA1区神经元形态变化Figure 1 Morphological changes of neurons in the CA1 region of the hippocampus in various groups of mice analyzed by Golgi staining experiment

表5结果显示：模型组小鼠树突分支数量显著减少，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠树突分支数量显著增加，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表5 各组小鼠树突分支数量比较Table 5 Comparison of the number of dendritic branches among various groups of mice（±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组电针组鼠数/只12 11 12树突分枝数量/个46.83±11.44 35.08±10.04①45.25±7.99②

2.5 各组小鼠海马组织Aβ斑块沉积和APP表达比较

Aβ斑块沉积可导致突触衰竭、树突和轴突受损[17]。Golgi staining实验发现，电针改善了神经元形态受损，因此，我们研究了这种作用是否可以改善卒中后认知障碍小鼠脑组织中的Aβ沉积。图2结果显示：模型组小鼠脑组织中Aβ沉积增加，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠海马组织中的Aβ沉积减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。APP是导致Aβ斑块形成的前体蛋白。本研究发现，模型组小鼠脑组织中APP表达增加，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组小鼠海马组织中的APP表达减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 各组小鼠脑组织Aβ、APP蛋白表达水平比较Figure 2 Comparison of protein expression levels of Aβ，APP among various groups of mice（±s）

3 讨论

3.1 电针百会、大椎穴能够有效改善缺血性卒中模型小鼠认知障碍

“通督调神”针刺法是许能贵教授基于《难经·二十八难》记载的“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，至风府，入于脑”。《素问·骨空论》记载督脉的分支“贯脊，属肾”“如循膂，络肾”“上贯心”及心主神明，脑为元神之府的理论构架提出的治疗缺血性脑病及其并发症的针刺方案。该方案主要取穴为百会、大椎穴，《太平圣惠方》和《针灸资生经》把该二穴记载在“中风七穴”之中。现代研究结果显示，百会、大椎穴具有提升椎基底动脉和大脑中动脉脑血流速度[18]和缓解急性、亚急性脑缺血再灌注损伤的作用[19]。本课题组前期临床试验已证实，“通督调神”针刺法可以有效改善血管性痴呆患者日常生活能力水平和神经功能缺损[4]。本次动物实验，考虑MCAO手术后小鼠肢体功能障碍可能会对新物体识别实验、水迷宫结果造成影响，但在预实验中，矿场实验结果显示：各组小鼠运动速度、运动距离、休息时间等自发活动差异无统计学意义，排除了MCAO手术导致的肢体功能障碍对认知行为学结果的影响。在接下来的新物体识别实验、水迷宫试验中MCAO诱导卒中后认知障碍模型小鼠显示出明显的认知障碍。然而，电针可以有效地改善认知功能障碍，进一步证明电针百会、大椎穴可以改善卒中后认知功能障碍。

3.2 电针百会、大椎穴能够保护受损神经元、促进神经功能恢复

海马在记忆的获取和储存过程中发挥重要作用[20]，海马神经元树突密度和学习记忆能力相关，当脑组织缺血缺氧造成神经元凋亡、树突密度降低，学习记忆能力将下降[21]。前期动物实验研究表明，MCAO诱导卒中后认知障碍模型动物树突密度降低。本实验中，卒中后认知障碍模型小鼠在高尔基染色实验中表现出同心圆交叉数量和树突分枝数量减少，再次证实，卒中后认知障碍模型小鼠存在神经元受损。同时，本研究发现，电针可有效改善神经元受损，证明电针百会、大椎穴能够保护受损神经元、促进神经功能恢复。

3.3 电针百会、大椎穴能够减少模型小鼠脑组织Aβ斑块沉积

有研究显示，Aβ沉积在卒中后认知障碍发生发展过程中发挥重要作用。动物研究发现，大脑中动脉闭塞后7 d内，梗死周围区域的APP出现了上调，随着APP分解Aβ肽逐渐增加并转化为致密的斑块样沉积[22]。Aβ沉淀聚积具有强神经毒性，可导致神经元树突密度降低和突触可塑性受损，从而造成认知障碍是卒中后认知障碍产生的重要机制[23]。抑制小鼠海马区Aβ沉积和APP表达可减轻海马神经元损害、改善认知障碍[24]。因此，本实验以Aβ和APP为观察指标，研究结果表明，电针百会、大椎穴能够抑制缺血性脑卒中小鼠海马组织中Aβ过度沉积和APP异常表达。

综上所述，电针百会、大椎穴可能是通过抑制卒中后认知障碍模型小鼠海马区Aβ沉积发挥神经元保护作用，从而改善认知功能障碍，为临床运用提供了实验证据。然而，本研究尚存在一定的局限性，比如电针对Aβ的作用点何在？是直接阻断其神经毒效应，还是阻碍其聚集沉积，或加速降解清除？其确切机制尚有待于进一步的研究。