miR-24-3p靶向BMP8B对成骨细胞功能影响的实验研究

王建琪, 李召宝, 吴帅楠, 郭香君, 曹素敏, 林秀雅, 褚亚辉

(河北省沧州市中心医院口腔科, 河北 沧州 061000)

牙周炎是由牙周袋内致病微生物引起的局部细菌感染性疾病，可造成牙齿支持组织的破坏，引起牙周附着丧失，严重时可发生牙齿的松动和掉落。其中人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)是牙周炎治疗后牙周新附着形成的主要细胞来源，是牙周组织再生的基础[1,2]。研究表明，牙骨缺损愈合的速度与成骨细胞的分化能力关系密切[3]。研究成骨细胞分化的分子机制对促进牙周组织再生有重要意义。Li等[4]研究显示，抑制miR-24-3p表达可通过靶向上调SMAD家族成员5表达促进hPDLSCs成骨分化。骨形态发生蛋白8B(Bone morphogenetic protein8B，BMP8B)是转录生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的成员之一，能够参与机体原始生殖细胞的发育、骨组织再生等重要生理过程[5]。生物信息学预测显示BMP8B可能是miR-24-3p的靶基因，但miR-24-3p是否通过调控BMP8B影响hPDLSCs成骨分化仍未有报道，因此本研究以hPDLSCs分离成骨细胞并探讨二者对成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响，为促进牙周组织再生提供新的分子靶标和一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1临床标本、试剂与仪器:在2020年5月至2020年10月选取本院因正畸而拔除的20颗完整、无龋坏的前磨牙，患者年龄12～18岁，无基础疾病、均签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审批并通过。DMEM培养基(A90113-500mL)；CCK-8试剂盒(FY600001-1ML)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(WK304)、碱性磷酸酶(application，ALP)活性检测试剂盒(YT6469)、BCIP/NBT ALP显色试剂盒(YT8174)、茜素红染色液(YT8939)，北京伊塔生物公司；LipofectamineTM3000转染试剂盒、蛋白提取试剂盒，美国艾美捷(武汉)公司(EF010-E、BC3711-50T)；BMP8B-siRNA序列，厦门慧嘉生物公司；反转录试剂盒、Trizol Reagent核酸分离试剂、AceQqPCR SYBR Green Mix、双荧光素酶报告基因检测试剂盒，北京百奥莱博科技有限公司(RP1105-100T、YT526、ALH185、KFS303-HUV)；兔抗人BMP8B(bs-3670R)、Ⅰ型前胶原前肽(procollagenⅠCpropeptide，PICP)(mYF9825)、骨钙素(又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白，Boneγ-Carbox- yglutamicacia-Containing protein，BGP)(YB-01221)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)(ATA34601)、β-actin(FT-B3350S)一抗、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗，武汉益普生物公司。二氧化碳细胞培养箱，美国ThermoFisher Scientific公司(型号BBD6220)；酶标仪、荧光定量PCR仪，美国Bio-rad公司(型号ELx800、C1000)；流式细胞仪，美国Beckman公司(型号CytoFLEX)。

1.2方 法

1.2.1hPDLSCs分离、培养及向成骨细胞诱导分化:①hPDLSCs分离及培养:将拔除的牙齿立即放入DMEM完全培养液中保存。依据参考文献[4]通过无菌操作刮取出牙周膜组织并剪碎、以含10%青霉素的PBS液冲洗，制成hPDLSCs单细胞悬液，离心并接种至含10%灭活FBS+1%双抗的DMEM中，在5%CO2培养箱中培养，温度保持在37℃。②HDPSCs向成骨细胞诱导分化:取生长良好的第3代HDPSCs接种至6孔板(5×104/孔)，更换为成骨细胞诱导培养液(含10%FBS+50mg/L α-左旋抗坏血酸+10mmoL/L β甘油磷酸二钠+0.1μmoL/L地塞米松+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素的DMEM培养基)，换液/2d，继续培养15d，采用碱性磷酸酶(application，ALP)染色及细胞矿化实验鉴定为成骨细胞[4]。收集成骨细胞消化并接种至24孔板(2.5×105个/孔)，进行传代培养。

1.2.2成骨细胞鉴定:取第4代成骨细胞继续培养48h，倒置显微镜下观察细胞形态。①ALP染色 取培养15d后的成骨细胞，消化并接种于室玻片上，根据BCIP/NBT ALP显色试剂盒进行染色，操作严格按照试剂盒说明书进行，倒置显微镜下观察并拍照。②茜素红染色 取培养15d后的成骨细胞，加入300μL 0.4%的茜素红S染液进行染色，显微镜下观察并拍照。

1.2.3细胞分组及转染:重悬1.2.1对数生长期的成骨细胞，并将其接种于24孔板(2.5×105个/孔)。然后，将成骨细胞随机分为4组(每组均6个复孔)，即空白对照组(正常培养成骨细胞不做特殊处理)；inhibitor-NC组(50 pmoL/μL inhibitor-NC)；miR-24-3p-inhibitor组(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor)；miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor及5μL BMP8B-siRNA)，以上质粒转染均严格参照Lipofectamine TM3000的说明书进行，Lipofectamine TM3000的剂量为5μL。用含10%灭活FBS+DMEM完全培液继续培养细胞48h。收集各组成骨细胞备用。

1.2.4实时定量聚合酶链反应:TRIzol法从1.2.3各组培养48h的成骨细胞中提取其总RNA，并测定浓度。按照PrimeScript RT reagent试剂盒的说明书将RNA逆转录合成cDNA。反应体系(20μL)包括：10μL ULtraSYBR mixture、2.0μL cDNA、2.0μL上游引物、2.0μL下游引物、4.0μL ddH2O。反应条件为：93℃预变性30s、93℃变性5s、65℃退火30s、延伸30s，循环40次。引物序列(泓迅生物，苏州)详见表1。采用2-ΔΔCt方法计算各组成骨细胞中miR-24-3p、BMP8B mRNA水平相对表达量。

表1 miR-24-3p BMP8B及内参引物序列

1.2.5CCK-8法:收集1.2.3培养48h的各组成骨细胞，调整密度至每孔2.5×105个细胞，接种在24孔细胞板上，24h后，加入CCK-8试剂，再培养2h，在490 nm处检测各孔细胞光密度(optic density，OD)值，并以此为基础计算增殖抑制率(%)，其计算公式为增殖抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。

1.2.6流式细胞术:取1.2.3各组培养48h的成骨细胞，制备成细胞悬液(1×106个/mL)。100μL细胞悬液中加入AnnexinV/PITC 5μL，20μg/mL的PI10μL，充分混匀，避光孵育30min(室温)，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡率。

1.2.7ALP活性检测:取1.2.3各组培养48h的成骨细胞，采用ALP活性检测试剂盒检测成骨细胞ALP活性，严格按照试剂盒说明书操作，以全自动酶标仪测定各样品520nm吸光度(Optical density，OD)值，在ALP标准曲线上读取酶活性值。

1.2.8免疫印迹法:收集1.2.3培养48h的各组成骨细胞，提取总蛋白后进行浓度检测，然后用等量蛋白进行SDS-PAGE(10%)，转膜、封闭后，添加BMP8B一抗及PICP、BGP、OPN一抗(均1∶1000稀释)，4℃孵育过夜，然后加入山羊抗兔二抗(HRP标记，1∶5000稀释)孵育1h。化学显色后进行成像。分析各孔蛋白条带灰度值。

1.2.9双荧光素酶报告基因实验:TargetScan预测miR-24-3p与BMP8B的核苷酸结合位点，构建BMP8B野生型质粒(BMP8B-WT)和突变型质粒(BMP8B-MT)。使用Lipofectamine TM3000将上述质粒分别与miR-24-3p-inhibitor-NC、miR-24-3p-inhibitor共转染于成骨细胞，48h后，以自动荧光素酶检测仪测定海肾荧光素、萤火虫荧光素的荧光强度，并计算相对荧光素酶活性。

2 结 果

2.1成骨细胞的鉴定:细胞呈现粘附生长，且呈现多种不规则形态，包括梭形、三角形或多角形等，突起较多，胞核位于细胞一侧呈卵圆形，符合成骨细胞形态学特征(图1a)。ALP染色结果显示，细胞核呈蓝色阳性反应，胞质及周围有棕色颗粒(图1b)。茜素红染色结果显示，细胞有较多深红色钙化结节形成(图1c)。以上结果表明诱导分化的细胞为成骨细胞。

图1 成骨细胞鉴定

2.2各组成骨细胞转染效果比较:miR-24-3p-inhibitor组和inhibitor-NC组成骨细胞均可见较强绿色荧光。与空白对照组、inhibitor-NC组比较，miR-24-3p-inhibitor组成骨细胞miR-24-3p水平显著降低(P<0.05)。详见图2及表2。

图2 转染效果比较

表2 各组成骨细胞miR-24-3p水平比较

2.3各组成骨细胞增殖情况比较:与空白对照组、inhibitor-NC组比较，miR-24-3p-inhibitor组成骨细胞增殖抑制率显著降低(P<0.05)；与miR-24-3p-inhibitor组比较，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组成骨细胞增殖抑制率显著升高(P>0.05)。详见表3。

表3 各组成骨细胞增殖情况比较

2.4各组成骨细胞凋亡情况比较:与空白对照组、inhibitor-NC组比较，miR-24-3p-inhibitor组成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与miR-24-3p-inhibitor组比较，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组成骨细胞凋亡率显著升高(P>0.05)。详见图3及表4。

图3 各组成骨细胞凋亡情况比较

表4 各组成骨细胞凋亡情况比较

2.5各组成骨细胞ALP活性比较:与空白对照组、inhibitor-NC组比较，miR-24-3p-inhibitor组成骨细胞ALP活性显著升高(P<0.05)；与miR-24-3p-inhibitor组比较，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组成骨细胞ALP活性显著降低(P>0.05)。详见表5。

表5 各组成骨细胞ALP活性比较

2.6各组成骨细胞中功能活性相关蛋白表达比较:与inhibitor-NC组、空白对照组比较，miR-24-3p-inhibitor组成骨细胞功能活性相关蛋白PICP、BGP、OPN显著升高(P<0.05)；与miR-24-3p-inhibitor组比较，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组成骨细胞功能活性相关蛋白PICP、BGP、OPN显著降低(P<0.05)。详见图4及表6。

图4 各组成骨细胞功能活性相关蛋白表达比较

表6 各组成骨细胞功能活性相关蛋白表达比较

2.7miR-24-3p靶向调控BMP8B:Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测显示，miR-24-3p与BMP8B存在核苷酸结合位点，详见图5。成骨细胞中，miR-24-3p-inhibitor显著升高了BMP8B-WT的荧光素酶活性(1.37±0.21)(P<0.05)，而不影响BMP8B-MUT的荧光素酶活性，详见图6。与空白对照组、miR-24-3p-inhibitor-NC组相比，miR-24-3p-inhibitor组BMP8B mRNA、蛋白表达明显增高(P<0.05)；与miR-24-3p-inhibitor组比较，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA组BMP8B mRNA及其蛋白表达显著降低(P<0.05)。详见图7及表7。

图5 靶向关系

图6 荧光素酶活性测定

图7 各组成骨细胞BMP8B蛋白表达

表7 各组成骨细胞BMP8B mRNA及其蛋白表达情况

3 讨 论

近年来miRNAs对成骨细胞分化调节的相关研究层出不穷[6,7]。miR-24-3p属于miRNAs家族重要一员，Wu等[8]研究显示，下调miR-24-3p表达能够促进牙髓干细胞成骨分化。然而miR-24-3p对牙周炎和骨分化调控作用机制尚不明确。基于此本研究以hPDLSCs为研究对象并诱导分化成骨细胞，分析miR-24-3p对成骨细胞增殖、凋亡的影响，并探究可能的分子机制，为临床治疗牙周病提供新的靶点和思路。本研究对hPDLSCs成骨诱导后显示，细胞呈成骨细胞形态，且多数细胞ALP呈阳性(蓝色)染色、有红色矿化结节产生，说明成骨细胞诱导成功。成骨细胞增殖分化及凋亡状态异常是影响骨重塑的重要因素[8]。ALP是早期成骨标志因子，能够促进成骨细胞成熟、钙化，其活性是反映成骨细胞分化程度及功能状态的良好指标[9]。PICP是成熟骨细胞合成并分泌的胶原基质蛋白，是骨基质的主要有机成分；BGP是一种特异性非胶原基质蛋白，也是成骨细胞分化成熟的一种特异性标志物；而成骨细胞分化成熟的晚期标志物OPN能够促进成骨细胞增殖与分化[10,11]。本研究结果显示，抑制miR-24-3p表达后成骨细胞增殖抑制率、凋亡率降低，ALP活性及PICP、BGP、OPN蛋白表达升高，与Wu等[8]研究结果一致，说明抑制miR-24-3p表达可能促进成骨细胞增殖分化并抑制细胞凋亡。

BMP8B是一种多功能的生长因子，属于TGF-β超家族成员，能够调控骨形成[12]。既往研究显示，过表达BMP8B能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化[13]。本研究结果显示，抑制miR-24-3p表达后成骨细胞BMP8B mRNA及其蛋白表达水平升高，提示抑制miR-24-3p表达可能上调BMP8B表达促进成骨细胞增殖分化并抑制凋亡。当在抑制miR-24-3p的基础上沉默BMP8B表达后，成骨细胞增殖分化能力被抑制，凋亡能力被提高。更加说明抑制miR-24-3p表达促进成骨细胞增殖分化及抑制凋亡，可能是通过上调BMP8B表达实现的。Chen等[14]过表达miR-24能够靶向下调TGF-β1表达抑制心肌纤维化进展。本研究经targetscan预测和双荧光素酶报告实验证实了miR-24-3p与BMP8B的靶向关系。以上结果说明抑制miR-24-3p表达可能通过靶向上调BMP8B表达促进成骨细胞增殖分化并抑制细胞凋亡。

综上所述，下调miR-24-3p表达能促进成骨细胞增殖分化并抑制细胞凋亡，可能是通过靶向上调BMP8B表达实现的，可为治疗牙周病提供新的思路。然而牙周病发病机制复杂，有关miR-24-3p靶向调控BMP8B参与成骨细胞生物学行为是否与其他通路有关，有待进一步深入阐述。