芍药苷调节LKB1-AMPK信号通路对LPS诱导的牙周膜干细胞凋亡和成骨分化的影响

梅 妹， 苟雅萍， 郭 艳， 杨彦伟， 郭 娅， 李健学

(1.联勤保障部队第九四〇医院口腔科， 甘肃 兰州 730050 2.兰州大学口腔医学院口腔内科， 甘肃 兰州 730000)

牙周炎发病率高，主要由细菌菌斑沉积在牙齿上、口腔卫生差、免疫反应失衡、牙齿炎症等因素造成牙齿脱落，属于一种慢性炎症性疾病[1]。目前治疗牙周炎的方法主要是手术、抗生素、洁治等，虽然取得了很大的进步，但治疗效果仍不尽如人意[2]。因此迫切需要找寻一种高效治疗牙周炎的方法。牙周膜干细胞(periodontal ligament cells，PDLSCs)具有高增殖、自我更新、多向分化的特点，据报道慢性牙周炎患者牙周组织中PDLSCs的分化潜能受损，导致其再生能力下降。因此克服炎症是PDLSCs分化过程中的关键[3]。芍药苷(paeoniflorin，PF)是芍药提取物的主要成分之一，具有调节蛋白质、抗炎、保护胶质细胞、抗氧化、抗凋亡等重要作用，但PF治疗牙周炎的报道甚少。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞能量状态的主要传感器，Wen等[4]研究发现PF通过激活LKB1/AMPK信号通路减轻肠道缺血再灌注受损。但PF能否通过调节LKB1/AMPK信号通路改善LPS诱导的PDLSCs损伤尚不清楚。本研究旨在探讨PF调节LKB1/AMPK信号通路对LPS诱导的PDLSCs凋亡和成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1细胞来源:上海钰博生物科技有限公司提供人PDLSCs，将细胞在含有10% FBS的DMEM中培养，并置于37℃的CO2培养箱中。

1.2主要材料、仪器:DMEM培养基、FBS溶液(Gibco公司)；茜素红染色(上海生工生物工程公司)；RIPA裂解缓冲液、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(碧云天生物有限公司)；二辛可宁酸(bicinchonininc acid，BCA)测定试剂盒(ProteinTech Group)；TRIzol试剂(Invitrogen公司)；PrimeScript RT试剂盒(Takara Bio)；肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 ELISA试剂盒测定(武汉博斯特生物科技有限公司)；LPS、PF、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK及天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)一抗(Abcam公司)。流式细胞仪(BD Biosciences)；Varioskan LUX多模式酶标仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.3细胞分组及处理:收集对数生长期的PDLSCs，设置分组为对照组、LPS组、LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组、LPS+PF-H+LKB1抑制剂(radicicol)组。其中对照组不做任何处理；LPS组10μg/mL LPS处理细胞；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组在LPS组基础上以5μmoL/L PF、10μmoL/L PF、20μmoL/L PF处理细胞；LPS+PF-H+radicicol组在LPS+PF-H组基础上经10μmoL/L radicicol处理细胞。培养基每3天更新一次，细胞培养21d后检测各指标。

1.4ELISA检验细胞中炎症因子水平:各组PDLSCs经胰蛋白酶裂解，并在4℃下以16000 × g离心15min，收获上清液。按照ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡:将各组PDLSCs在室温下以700 × g 离心5min，然后轻轻重悬于500μL Annexin V-FITC溶液中，室温避光孵育10min后，随后向细胞中加入10μL PI染色液并在冰浴中避光孵育30min。流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.6茜素红染色观察矿化结节:将细胞以1×105个细胞的密度接种到24孔板中。处理的细胞在室温下用4%甲醇固定15min，并在37℃下用茜素红染色30min。随机选五个视野在倒置光学显微镜下评估PDLSCs的矿化能力。

1.7ALP试剂盒检测细胞成骨分化:洗涤各组PDLSCs，加入50μL分析缓冲液，然后在4℃下以11900 × g离心3min。随后将50μL PNPP反应溶液添加到每个孔中，并在60℃下避光反应60min。最后加入20μL终止液终止反应，在450 nm处测定吸光度值评估ALP活性。

1.8qRT-PCR检测OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平:使用TRIzol试剂从各组PDLSCs中提取总RNA，PrimeScript RT试剂盒将2μg总RNA反转录为cDNA，mRNA表达定量通过RT-qPCR试剂盒进行Real Time PCR反应，mRNA表达以β-actin为参照。使用2-△△CT计算OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9western blot检测LKB1/AMPK通路及caspase-1蛋白表达水平:RIPA裂解缓冲液在4℃裂解PDLSCs，BCA试剂盒测蛋白质浓度，经10% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上、封闭2h，4℃下将膜与p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK、caspase-1、β-actin一抗孵育过夜，之后加入二抗，可视化蛋白条带并拍照，Image分析蛋白灰度值。

2 结 果

2.1PF对各组细胞中矿化结节的影响:LPS组茜素红染色程度较对照组减轻，矿化结节减少；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组茜素红染色程度较LPS组逐渐恢复，矿化结节逐渐增多；LPS+PF-H+radicicol组茜素红染色程度较LPS+PF-H组加深，矿化结节减少。见图1。

图1 各组PDLSCs的茜素红染色图(×100)

2.2PF对各组细胞中凋亡率的影响:LPS组较对照组细胞凋亡率均增加(P<0.05)；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组较LPS组细胞凋亡率显著降低，呈现剂量依赖性(P<0.05)；LPS+PF-H+radicicol组较LPS+PF-H组细胞凋亡率均显著增加(P<0.05)，见图2 ，表2。

图2 各组PDLSCs凋亡变化

表2 各组PDLSCs凋亡比较

2.3PF对各组细胞中ALP活性的影响:LPS组较对照组ALP活性均显著降低(P<0.05)；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组较LPS组ALP活性显著升高，呈现剂量依赖性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol组ALP活性较LPS+PF-H组显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组细胞中ALP活性比较

2.4PF对各组细胞中炎症因子水平的影响:TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较：LPS组较对照组、LPS+PF-H+radicicol组较LPS+PF-H组显著升高(P<0.05)；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组较LPS组显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较

2.5PF对各组细胞中OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平的影响:LPS组OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平较对照组显著降低(P<0.05)；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组较LPS组OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平显著升高，呈现剂量依赖性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol组OPN、RUNX2、OCN mRNA表达水平较LPS+PF-H组显著下降(P<0.05)，见表5。

表5 各组细胞OPN RUNX2 OCN mRNA表达水平比较

2.6PF对各组细胞LKB1/AMPK通路及caspase-1表达水平的影响:LPS组p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK较对照组显著降低，而caspase-1表达增加(P<0.05)；LPS+PF-L组、LPS+PF-M组、LPS+PF-H组较LPS组p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK水平显著升高，而caspase-1表达下降，呈现剂量依赖性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol组p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK水平较LPS+PF-H组显著下降，caspase-1表达增加(P<0.05)，见图3、表6。

表6 各组细胞中p-LKB1/LKB1 p-AMPK/AMPK caspase-1表达的比较

图3 各组细胞中p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、caspase-1表达(Western blot图)注：A为对照组；B为LPS组；C为LPS+PF-L组；D为LPS+PF-M组；E为LPS+PF-H组；F为LPS+PF-H+radicicol组

3 讨 论

牙周炎可使成人牙齿脱落，与多种全身性疾病密切相关,据报道PDLSCs是一类口腔成体干细胞，具有非定向分化潜能，与牙周组织的再生修复密切相关[5]。因此探索PDLSCs成骨分化机制对于更好地治疗牙周炎意义重大。本研究以LPS诱导PDLSCs构建牙周炎细胞模型 ，进一步探索新的治疗方法。

PF是从传统中草药芍药中提取得到，具有神经保护、抗高血糖、保肝、抗肿瘤等特性，尤其是抗炎方面疗效显著。在LPS诱导的小鼠心肌损伤中[6]，PF可以降低炎症细胞因子的释放，阻止细胞凋亡，改善心肌受损，可作为心肌缺血并发症的潜在药物。特别是在实验性牙周炎大鼠模型中，PF可增加牙槽骨面积，减少牙槽骨吸收、附着，但具体机制尚不清楚[7]。本研究发现经PF-L、PF-M、PF-H处理LPS诱导的PDLSCs后，炎症因子水平逐渐减少，细胞凋亡率降低，caspase-1表达被抑制。提示PF可抑制LPS诱导PDLSCs的细胞凋亡，减轻其炎性反应。

RUNX2在成骨过程中是不可或缺的转录因子，也是成骨分化的关键所在，参与调节成骨分化相关标记物有ALP、OPN、OCN等[8]。本实验研究发现LPS诱导PDLSCs中矿化结节减少，ALP水平及OPN、RUNX2、OCN表达降低，表明LPS诱导后，PDLSCs成骨分化被抑制。经PF-L、PF-M、PF-H处理后，矿化结节显著增加，ALP水平及OPN、RUNX2、OCN表达上调，表明PF在一定程度上可以促进LPS诱导PDLSCs的成骨分化。另外，LKB1是一种普遍表达且进化保守的丝氨酸苏氨酸激酶，可正向调节AMPK表达。Zheng等[9]研究发现激活LKB1/AMPK通路可抑制缺血再灌注大鼠中炎症、氧化应激和细胞凋亡。除此之外，实验结果显示二甲双胍可通过激活LKB1/AMPK信号，降低促炎细胞因子水平，促进成骨细胞分化，增强牙周和骨组织再生[10]。本实验研究发现LPS诱导PDLSCs中，LKB1与AMPK磷酸化水平显著降低，提示抑制LKB1/AMPK通路可能参与LPS诱导PDLSCs的成骨分化及凋亡。经PF-L、PF-M、PF-H处理后，LKB1与AMPK磷酸化水平上调，细胞凋亡降低，成骨分化能力增强，推测PF可能通过激活LKB1/AMPK通路实现上述指标转变。为验证上述推测，以LKB1抑制剂-radicicol进行回复验证，结果发现radicicol逆转了PF-H对LPS诱导的PDLSCs凋亡和成骨分化的作用，表明PF通过上调LKB1-AMPK信号通路抑制LPS诱导的PDLSCs凋亡，促进其成骨分化。综上所述，PF可以促进LPS诱导的PDLSCs成骨分化，抑制其凋亡，可能与LKB1-AMPK信号通路活化有关，为牙周炎治疗提供新方案。