红花黄色素调节NF-κB/NLRP3信号通路对心肌梗死大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的影响

赵 雯， 张 勇， 张 波， 安 笑， 陈瑞敏， 任 超

(解放军第九六〇医院， 山东 济南 250031)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是国内外发病率和死亡率最高的心脑血管系统疾病之一，其发病时，导致细胞坏死和组织损伤的心肌缺血是心源性猝死的原因之一[1]。临床上虽已采用ACEⅠ、ARB及β受体阻滞剂等药物来稳定或改善MI患者的心功能障碍，但其预后仍不理想，且长期应用带来的耐药性和不良反应也为临床应用带来挑战。因此，寻找药物减轻MI心肌细胞焦亡和炎性损伤具有重要意义。红花黄色素(Carthamin yellow，CY)是从菊科植物红花花瓣中提取而得，是一种可溶性查尔酮混合物，包括羟基CY A、CY A、CY B、槲皮素、山奈酚等。其中含量最高的是羟基SY A ，是主要的有效成分[2]。因羟基SY A需要对CY进行进一步分离、提纯、纯化等过程，且提取的单体易受到光照、温度而影响稳定性，本实验采用混合物CY作为研究对象。研究发现CY具有抑制血栓形成、抗心肌缺血、降血脂、抗氧化等药理作用[3]。刘广雁等[4]发现CY对心肌细胞H9C2具有保护作用。目前关于CY发挥生物学功能的机制尚不明确，对MI大鼠的心肌细胞焦亡与炎性损伤存在的影响值得研究和探讨。研究表明NF-κB/NLRP3信号通路与细胞焦亡与炎症反应相关，其过度激活可能导致炎症性疾病的发生[5]，但在MI中的作用及其机制尚不清楚。本研究通过结扎左前降支法建立MI大鼠模型，给予CY干预，并予以腹腔注射NLRP3激活剂LPS，观察CY对MI大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的影响，及NF-κB/NLRP3信号通路在其中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级SD大鼠72只，雄性，250g～280g，购自博济医药科技股份有限公司，生产许可证号：SYXK(粤)：2022-0279。实验前饲养于采光良好、通风的实验室，温度(22±1)℃，相对湿度40%～60%，自由饮水、进食。适应性饲养一周后开始实验，本实验已得到本院的动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂:红花黄色素(CY)购自于广州威佳科技有限公司；戊巴比妥钠购自于Sigma公司；注射用青霉素钠购自瑞阳制药有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自于北京索莱宝科技有限公司；伊文思蓝(EB)购自上海生工生物公司；NF-κB激活剂LPS购自于美国Peprotech公司；NLRP3、NF-κB、GSDMD-N、cleaved-caspase1、β-actin抗体及其二抗购自于Abcam公司；大鼠LDH、IL-1β、IL-18检测试剂盒购自于上海生工生物公司；RIPA裂解液购自于上海碧云天生物技术有限公司。

1.3MI大鼠模型的建立:参考文献[6]方法，随机选取60只大鼠通过冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型。通过腹腔注射新鲜制备的2%戊巴比妥钠(10mL/kg)来麻醉大鼠。将大鼠固定于仰卧位置，行气管插管，并连接呼吸机，同时进行大鼠心电图监测。于胸骨左侧3～4个肋骨间以20～30度的角做一个1cm长的纵行切口，将胸肌逐层分离后，在大鼠胸部第3-4个肋骨间隙最宽处用眼睑器固定，暴露心脏。随后迅速在大鼠平左心耳底部用6-0号线结扎左前降支近端。最后关闭胸腔，缝合肌肉层，排除胸腔内空气，手术部位用注射用青霉素钠浸润，缝合皮肤。当观察到手术过程中结扎区周围心肌组织发白，心电图J点位置抬高时，说明MI大鼠模型建立成功。共造模成功48只大鼠，随机分为4组，分别是MI模型组(Model组)、低剂量CY组(CY-L组，20mg/kg)、高剂量CY组(CY-H组，40mg/kg)和高剂量CY+NF-κB激活剂组(CY-H+LPS组，CY 40mg/kg+LPS 10mg/kg[7])，每组12只。另取12只大鼠作为对照组(Control组)，12只大鼠作为假手术组(Sham组)。Control组只进行麻醉操作，Sham组麻醉后开胸腔暴露心脏，只穿线不结扎。手术后灌胃给药，CY-L组腹腔注射CY 20mg/kg，CY-H组腹腔注射CY 40mg/kg，CY-H+LPS组注射CY 40mg/kg和LPS 10mg/kg，Control组、Sham组和Model组腹腔注射同等体积的生理盐水。每日一次，共给药28d。

1.4大鼠心电图检查:末次给药后，腹腔麻醉大鼠后行心电图检查。观察并记录各组大鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收缩压(LV systolic pressure，LVSP)、左室收缩末期容积(LV end-systolic volume，LVESV)、左室短轴缩短率(LV fractional shortening，LVFS)、左室舒张压(LV end-diastolic pressure，LVEDP)、左室舒张末期容积(LV end-diastolic volume，LVEDV)，每个指标均观察并测量3个心动周期，计算出均值。

1.5TTC-EB染色法测定大鼠心肌梗死面积:给药结束后，每组选取6只大鼠处死，经颈总动脉逆行注射0.5% EB溶液1mL，摘除心脏，PBS洗涤后放入-20℃冻存过夜。次日横向将左心室切成厚度越2mm的切片共5片，切片浸入1% TTC溶液(37℃)并孵育20min，之后用多聚甲醛固定，使用ImageProPlus软件计算大鼠心脏切片的梗死面积。染色后观察切片，其中正常心肌呈蓝色，梗死心肌呈白色，缺血心肌呈红色。

1.6苏木精-伊红(HE)和Masson染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化:处死剩余大鼠并解剖取出心脏，将小于结扎线 0.5mm 的心肌组织浸于10%甲醛溶液中固定，酒精脱水、石蜡包埋、切片机切片，HE和Masson染色后于观察各组大鼠心肌组织的病理学和纤维化变化。另取余下梗死处及边缘心肌组织剪碎，储存于-80℃。

1.7免疫荧光法检测各组大鼠心肌细胞焦亡:取出1.6中制备的心肌切片，经去石蜡、抗原修复、透化后，然后用2%山羊血清封闭，加入一抗cleaved-caspase1(1∶300)和NLRP3(1∶200)，在4℃环境下孵育过夜。次日于暗处加入相应的二抗溶液(1∶500)并孵育45min，之后在暗处再加入DAPI试剂孵育10min，在荧光显微镜下观察记录焦亡状态的心肌细胞数量，计算焦亡心肌细胞百分比。

1.8检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和LDH水平:取1.6中冻存的心肌组织，加入冰生理盐水于超声匀浆机中3000 r/min制备10%心肌组织匀浆液。按IL-1β、IL-18和LDH试剂盒说明书检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和LDH水平。

1.9Westren blot检测各组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白的表达:取1.6中冻存的心肌组织，研磨后加入RIPA裂解缓冲液提取心肌组织总蛋白，BCA试剂盒对蛋白定量，经过凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，将膜与一抗NF-κB(1∶2000)、NLRP3(1∶4000)、GSDMD-N(1∶2000)、cleaved-caspase1(1∶3000)及β-actin(1∶5000)4℃孵育过夜；次日摇床复温，清洗膜，加入相应二抗接着孵育2h。使用ECL显色剂进行显色，经Image Lab软件分析计算各个蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，计算NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白相对表达水平。

2 结 果

2.1各组大鼠心功能指标:与Control组相比，Sham组无统计学意义(P>0.05)。与Sham组相比，Model组大鼠LVEF、LVSP及LVFS降低，LVEDV、LVESV和LVEDP升高，具有统计学差异(P<0.05)。与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP显著降低(P<0.05)。与CY-L组相比，CY-H组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP显著降低(P<0.05)。与CY-H组大鼠相比，CY-H+LPS组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著降低，LVEDV、LVESV和LVEDP显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较

2.2各组大鼠心肌梗死面积比较：Control组和Sham组大鼠无心肌梗死。与Sham组相比，Model组大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.05)；与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠心肌梗死面积显著减少(P<0.05)；与CY-L组相比，CY-H组大鼠心肌梗死面积显著减少(P<0.05)；与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.05)。实验结果见表2、图1。

表2 各组大鼠心肌梗死面积比较

图1 各组大鼠心肌组织TTC-EB染色

2.3各组大鼠心肌组织病理学变化：HE染色和Masson染色切片图如图2、图3所示。Control组和Sham组大鼠心肌细胞排列规则，形态完整，无坏死和炎性细胞浸润，极少量的胶原纤维沉积；Model组大鼠心肌细胞肿大、排列紊乱，片状坏死，可见大量炎性细胞浸润，大量胶原纤维沉积；与Model组比较，CY-L组和CY-H组大鼠心肌组织病理损伤减轻，心肌细胞坏死数量减少，炎性浸润减轻，胶原纤维沉积减少；与CY-H组相比，CY-H+LPS组心肌组织病理损伤严重，细胞大量水肿坏死，胶原纤维沉积增多。

图2 各组大鼠心肌组织HE染色(×200)

图3 各组大鼠心肌组织Masson染色(×200)

2.4各组大鼠心肌细胞焦亡情况比较：Control组和Sham组基本无焦亡心肌细胞。与Sham组相比，Model组心肌细胞焦亡比例显著增加(P<0.05)；与Model组相比，CY-L组、CY-H组大鼠心肌细胞焦亡比例显著降低(P<0.05)；与CY-L组相比，CY-H组大鼠心肌细胞焦亡比例显著降低(P<0.05)；与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠心肌细胞焦亡比例显著增加(P<0.05)。结果见表3、图4。

图4 大鼠心肌免疫荧光结果(DAPI，×200)注：箭头所指为各组大鼠焦亡心肌细胞

表3 各组大鼠心肌细胞焦亡比例

2.5各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18及LDH水平比较：与Control组相比，Sham组无统计学差异(P>0.05)。与Sham组比，Model组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著升高(P<0.05)；与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著降低(P<0.05)；与CY-L组相比，CY-H组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著降低(P<0.05)；与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著升高(P<0.05)。实验结果见表4。

表4 各组大鼠心肌组织中IL-1β IL-18及LDH水平比较

2.6各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较:与Control组相比，Sham组无统计学差异(P>0.05)。与Sham组相比，Model组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与Model组相比，CY-L组、CY-H组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与CY-L组相比，CY-H组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。实验结果见表5、图5。

图5 各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较注：A：Control组；B：Sham组；C：Model组；D：CY-L组；E：CY-H组；F：CY-H+LPS组

表5 各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较

3 讨 论

MI是一种严重的冠心病临床类型，在发达国家导致每年超过1/3的患者死亡，是全球死亡和残疾的主要原因之一，给人们生命健康带来威胁[8]。本研究采用冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型，该种模型在传统的徐氏方法基础上进行改良，大大提高了造模成功率。结果显示MI模型组大鼠LVESV、LVEDP、LVEDV升高，LVEF、LVSP、LVFS降低，切片显示心肌梗死面积约为(43.28±3.79)%，提示MI模型大鼠心肌缺血、心功能下降。

细胞焦亡是新定义的一种细胞死亡方式，其与炎症相关。当细胞发生焦亡时，细胞体积增加，细胞膜破裂穿孔，内容物流出，形成活化的焦亡小体，释放炎症因子进而加重炎症反应，致组织损伤和病理学变化[9]。有研究显示，心肌细胞焦亡参与了心衰的发生发展，也在心肌缺血/再灌注损伤中发挥了重要的作用[10]。而关于心肌细胞焦亡是否也参与了MI，目前研究较少。本研究建立MI大鼠模型后发现，Model组大鼠心肌组织中LDH水平增加，说明损伤了心肌细胞膜；大鼠心肌组织中细胞焦亡所占百分比显著升高(P<0.05)，炎症因子IL-1β、IL-18增多，这些可能引起心肌组织坏死，造成心肌组织炎性损伤。HE染色和Masson染色结果显示心肌细胞肿大、排列紊乱，有大量炎性细胞浸润，并出现大量胶原纤维沉积，这些都是明显的炎性损伤特征。结果说明心肌细胞焦亡在MI发生、发展过程中发挥了重要的作用，且炎性损伤有可能导致了MI和心功能的下降。

目前，中医药因其毒副作用较小，治疗MI疗效确切，将其与西医结合应用于MI已成为医药界研究热点与趋势。CY作为红花的有效成分，市售的注射用红花黄色素在活血化瘀方面的临床效果优于红花。Lu等[11]研究发现CY能通过减少活性氧的释放和炎症反应来保护心脏免受缺血/再灌注损伤；Guo等[12]发现CY能通过减轻大鼠炎症反应和铁死亡来改善脑缺血/再灌注损伤。但CY在MI中对心肌细胞焦亡和炎性损伤的作用还鲜有报道。本研究结果显示，与Model组大鼠相比，CY-H组大鼠心功能明显改善，心肌组织的炎症损伤和细胞焦亡减弱，IL-1β、IL-18和LDH释放减少，说明CY能减轻MI的炎性损伤。

NLRP3是一种炎症小体复合物，在细胞焦亡中发挥了重要的作用。当细胞受到危险信号后，NLRP3、ASC和pro-caspase1相互组装导致pro-caspase1分解为活性cleaved-caspase1[13]。cleaved-caspase1促进IL-1β的成熟和分泌，诱导了组织炎性损伤。GSDMD被催化裂解为GSDMD-N和GSDMD-C，其中GSDMD-N能导致与炎症相关的细胞焦亡，且GSNMD受到NF-κB的调控。本研究结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达显著升高(P<0.05)，诱导了心肌细胞炎性损伤和细胞焦亡。与Model组相比，CY-H组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达显著降低，且减轻了心肌组织炎性损伤和细胞焦亡。推测CY可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路减轻MI导致的心肌细胞焦亡和炎性损伤。为了验证此猜想，本研究利用NF-κB的激活剂LPS来干预高剂量CY处理的MI大鼠。结果显示，LPS减弱了高剂量CY对MI大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的抑制作用。证实了CY可能抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌细胞焦亡，减轻炎性损伤。

综上所述，CY可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌细胞焦亡，减轻炎性损伤。该研究为开发用于MI临床治疗的新型药物提供了新的思路和方法。然而，该项研究还存在不足之处，NLRP3介导的细胞焦亡可能还涉及了其他通路，还需进一步设计实验进行研究。