基于mTOR/p70S6K信号通路探究紫丁香苷对高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤的影响

姚春红， 李国红， 周 波， 徐 佳

(湖北省武汉市东西湖区人民医院综合医疗科， 湖北 武汉 430040)

糖尿病肾病(diabetes nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管病，是导致肾脏疾病终末期的重要诱因之一；DN在中国的患病率仅次于糖尿病性心血管疾病。DN被认为主要与代谢紊乱、血液动力学紊乱、氧化应激损伤、炎症和遗传因素有关。最近，大量研究表明，DN发病机理与足细胞损伤密切相关，足细胞参与肾小球滤过屏障[1]。紫丁香苷是一种苯丙醇苷类化合物，具有增强免疫力、降糖降脂、保肝、抗肿瘤、抗炎镇痛等药理作用[2]。有研究显示，紫丁香苷可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应，保护其神经功能，对缺血性中风具有治疗作用[3]。研究表明，足细胞的损伤和丧失通常是由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激活引起的，这可能导致肾小球疾病的进展[4]。p70核糖体蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)作为mTOR下游信号因子，可与mTOR共同作用影响多种疾病的进展[5]。牛晓静等[6]研究显示，mTOR/p70S6K信号通路可调控DN大鼠足细胞自噬，从而修复足细胞损伤。但紫丁香苷是否可通过mTOR/p70S6K信号通路影响足细胞损伤介导的DN尚未有研究报道。基于此本研究拟探究紫丁香苷对高糖诱导的足细胞损伤及mTOR/p70S6K信号通路的影响，为DN的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1细胞:小鼠足细胞MPC5购自北京龙跃生物科技发展有限公司，批号SJ19102。

1.1.2药物及试剂:紫丁香苷(纯度≥98%，原料药，货号134-19-7)购自江苏永健医药科技有限公司；重组小鼠干扰素-γ(IFN-γ)试剂(货号JN0913L)、化学发光试剂盒(货号JN1514L)购自广州威佳科技有限公司；RPMI 1640培养基(货号CK6017-5)、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂(货号CK7193-3)、细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC)(货号CK1923-7)、TRIzol试剂(货号CK2635-1)、RIPA裂解缓冲液(货号CK3617-9)、兔抗鼠二抗(货号CP5319-5)均购自北京百灵威科技有限公司；鬼笔环肽染色试剂(货号JT91347)、荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(货号JT10091)、鼠源mTOR(货号JT11352)、p70S6K(货号JT11573)、GAPDH(货号JT10014)一抗均购自郑州金图生物科技有限公司。

1.1.3仪器:酶标仪(型号DR3700)、流式细胞仪(型号iQue 3)、qRT-PCR仪(型号Q2000C)均购自上海然哲仪器设备有限公司；共聚焦显微镜(型号RCM200)、凝胶成像仪(型号CL750)均购自北京森西赛智科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1MPC5细胞培养及分组给药:将MPC5细胞置于RPMI 1640培养基中进行培养，培养基中添加10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，以及10U/mL重组小鼠IFN-γ。当MPC5细胞生长到70%～80%融合时，将它们转移至无IFN-γ的RPMI 1640培养基中，在37℃培养诱导分化2周。然后进行后续实验。依据文献[7,8]进行浓度设置，将MPC5细胞分为：对照组(5.5mmoL/L葡萄糖)[7]、高糖诱导组(30mmoL/L葡萄糖)[7]、紫丁香苷低浓度组(2.5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷中浓度组(5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷高浓度组[8](10μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)。各组向RPMI 1640培养基中加入上述浓度的相应试剂或药物，培养72h。每组设置8个重复。

1.2.2MPC5细胞增殖能力测定:收集1.2.1中给药结束后的各组MPC5细胞，将细胞接种到96孔板中(2000个/孔)，然后将20μL MTT(5mg/mL)添加到每个孔中，4h后，弃去上清液，加入150μL二甲基亚砜，振荡细胞悬液，并使用酶标仪测量480 nm波长处的吸光度值，计算细胞活力(细胞活力=各处理组吸光度值/对照组吸光度值×100%)。

1.2.3MPC5细胞凋亡能力测定:收集1.2.1中给药结束后的各组MPC5细胞，将细胞以1×106个/mL的密度重悬于800μL结合缓冲液中，加入10μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶，在黑暗中于25℃孵育25min，然后采用流式细胞仪分析MPC5细胞凋亡情况。

1.2.4MPC5细胞骨架形态观察:收集1.2.1中给药结束后的各组MPC5细胞，多聚甲醛固定细胞25min，PBS清洗，然后添加鬼笔环肽染色试剂(红光)150μL，避光染色60min，置于共聚焦显微镜下观察MPC5细胞骨架形态。

1.2.5MPC5细胞mTOR、p70S6K信使核糖核酸(mRNA)表达测定:收集1.2.1中给药结束后的各组MPC5细胞，使用TRIzol试剂提取MPC5细胞中总RNA，逆转录为cDNA，随后进行qRT-PCR反应。热循环条件如下：在93℃下初始变性57s；然后39个循环(93℃变性，16s、57℃退火，22s、71℃延伸，13s)。使用2-ΔΔCt法定量mTOR、p70S6K mRNA在细胞内的表达水平。引物序列如下：mTOR正向5'-GAGACCGAGTCGCTCAAGTCCTA-3'和反向5'-AGTCGGGATGTCTGCTGGTA-3'；p70S6K正向5'-GTACGTCGATCGATCGTAGCTCGATCGATGAGAGTC-3'和反向5'-CACTAGAGAGCTGCATGTAGCTAGCTGCTAGCTCGAT-3'；GAPDH正向5'-ACCTGACCTGCCGTAGAA-3'和反向5'-TCCACCCTGTTGCTGTA-3'。GAPDH被用作内部参考，北京密码子生物科技有限公司负责引物的设计合成。

1.2.6MPC5细胞mTOR、p70S6K蛋白表达测定:收集1.2.1中给药结束后的各组MPC5细胞，PBS洗涤两次，将细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解分离蛋白质，定量蛋白浓度后，取100μg的蛋白质进行电泳分离，转移蛋白质到聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶封闭后，添加鼠源mTOR(1∶380)、p70S6K(1∶380)、GAPDH(1∶480)一抗于4℃孵育12h，添加兔抗鼠二抗(1∶1700)于25℃孵育1.5h，化学发光试剂盒对蛋白条带进行显色，ImageJ软件进行定量分析。

2 结 果

2.1紫丁香苷对MPC5细胞增殖能力的影响:与对照组比较，高糖诱导组MPC5细胞吸光度值、细胞活力显著降低(P<0.05)；与高糖诱导组比较，紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞吸光度值、细胞活力依次升高(P<0.05)。见表1。

表1 紫丁香苷对MPC5细胞吸光度值和细胞活力的影响

2.2紫丁香苷对MPC5细胞凋亡能力的影响:与对照组比较，高糖诱导组MPC5细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与高糖诱导组比较，紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞凋亡率依次降低(P<0.05)。见表2、图1。

表2 紫丁香苷对MPC5细胞凋亡率的影响

图1 不同浓度紫丁香苷对MPC5细胞凋亡率的影响

2.3紫丁香苷对MPC5细胞骨架形态的影响:对照组MPC5细胞骨架形态正常，细胞长轴呈线性分布，荧光染色明显；高糖诱导组MPC5细胞骨架断裂，细胞萎缩，荧光染色黯淡；紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞骨架结构恢复清晰，荧光强度逐渐变亮，足突趋于明显；见图2。

图2 不同浓度紫丁香苷对MPC5细胞骨架形态的影响(鬼笔环肽染色，×400)

2.4紫丁香苷对MPC5细胞mTOR、p70S6K mRNA表达水平的影响:与对照组比较，高糖诱导组MPC5细胞mTOR、p70S6K mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；高糖诱导组比较，紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞mTOR、p70S6K mRNA表达水平依次降低(P<0.05)。见表3。

表3 紫丁香苷对MPC5细胞mTOR p70S6K mRNA表达水平的影响

2.5紫丁香苷对MPC5细胞mTOR、p70S6K蛋白表达水平的影响:与对照组比较，高糖诱导组MPC5细胞mTOR、p70S6K蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；高糖诱导组比较，紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞mTOR、p70S6K蛋白表达水平依次降低(P<0.05)。见表4、图3。

表4 紫丁香苷对MPC5细胞mTOR p70S6K蛋白表达水平的影响

图3 各组MPC5细胞mTOR、p70S6K蛋白印迹图注：A：对照组；B：高糖诱导组；C：紫丁香苷低浓度组；D：紫丁香苷中浓度组；E：紫丁香苷高浓度组

3 讨 论

足细胞是高度分化的上皮细胞，是肾小球滤过屏障功能的基本组成部分。足细胞损伤和凋亡是大量蛋白尿和肾小球硬化的原因，已成为DN的中心因素。因此，探索足细胞凋亡和损伤的机制将为DN的治疗提供重要的方法。研究发现，DN中足细胞的增殖和再生是有限的，其异常凋亡与DN的发生和进展有关[9]。本研究发现，高糖诱导组MPC5细胞骨架断裂，细胞萎缩，荧光染色黯淡，吸光度值、细胞活力显著降低，凋亡率显著增高，与Han等[10]的研究一致，表明高糖诱导的足细胞损伤模型建立成功。紫丁香苷具有多种药理作用，研究显示，紫丁香苷不仅能够抑制乳腺癌进展，还能改善骨关节炎大鼠软骨组织病理损伤[11,12]。此外，紫丁香苷还能通过改善β淀粉样肽诱导的人神经母细胞瘤细胞的神经毒性，恢复细胞活力、抑制细胞凋亡治疗阿尔茨海默病[13]。但目前未有紫丁香苷对足细胞损伤影响的文献报道。本研究结果显示，经紫丁香苷处理后，高糖诱导的MPC5细胞损伤减轻，细胞活力升高，凋亡率降低，且紫丁香苷浓度越高，效果越明显。提示紫丁香苷可能通过促进细胞增殖、抑制凋亡进而改善高糖诱导的MPC5细胞损伤。

mTOR/p70S6K信号通路可参与多种生理病理过程，影响细胞生长、分化、代谢等过程。研究显示，抑制mTOR/p70S6K信号通路可降低mTOR、p70S6K蛋白表达，从而抑制Caco-2细胞凋亡，减轻脂多糖诱导的Caco-2细胞屏障损伤[14]。文献表明小檗碱能抑制mTOR/p70S6K信号通路激活足细胞自噬，从而减轻高糖诱导的足细胞凋亡[15]。本研究结果发现，高糖诱导的MPC5细胞中mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达显著升高，与Li等[15]的研究结果一致，提示高糖环境可导致MPC5细胞中mTOR/p70S6K信号通路被激活。而高糖诱导的MPC5细胞经紫丁香苷处理后，mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达降低，且紫丁香苷浓度越高，降低幅度越大，表明紫丁香苷可抑制MPC5细胞中mTOR/p70S6K信号通路的激活。本研究结合上述结果推断紫丁香苷对高糖诱导的MPC5细胞损伤的保护作用可能与其能抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活有关。

综上所述，紫丁香苷对高糖诱导的MPC5细胞损伤具有保护作用，能明显促进MPC5细胞增殖，抑制其凋亡，其机制可能与抑制mTOR/p70S6K通路的激活有关。本研究的不足之处在于未设置mTOR通路激活剂组，下一步将采用mTOR通路激活剂进一步验证本研究的结果。