三七总皂苷抑制人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系增殖和促凋亡

贠丹丹， 耿 男， 李菊萍， 刘 璞， 张 婷

(1.西安医学院第一附属医院风湿免疫科， 陕西 西安 710077 2.西北政法大学公安学院， 陕西 西安 710061)

类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜增生、骨和软骨破坏为主要特征的慢性炎性关节疾病，严重时可造成患者残疾，影响患者生存质量。滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts，SF)是RA滑膜增生和侵袭的主要效应细胞，抑制SF增生和侵袭对控制RA发生发展尤为重要。三七总皂苷(PNS)是中药三七的主要活成分，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等药理活性。临床研究显示，PNS配合西药治疗RA有助于改善患者症状，降低疾病活动性[1]；另研究显示，PNS可减轻胶原诱导关节炎大鼠模型的炎症反应和滑膜血管形成；在兔关节炎模型中，PNS可保护软骨细胞免受RA相关损伤，减轻关节炎兔的关节破坏[2]。以上研究提示，PNS在RA的治疗中具有重要作用。miR-335-5p是RA滑膜组织和滑膜成纤维细胞中表达下调的微小RNA(miRNA)，上调miR-335-5p可通过靶向抑制DKK1的表达阻碍RASF增殖和侵袭，并诱导RASF凋亡，miR-335-5p是RA治疗的潜在分子靶点[3]。本研究探究PNS可能通过miR-335-5p对MH7A细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂：MH7A细胞系(宁波明舟生物科技有限公司)；PNS(南京本草益康生物科技有限公司(纯度98%))；胎牛血清(浙江天杭)；BCA蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒、DMEM培养液、LipofectamineTM 2000试剂盒和CCK-8试剂盒(均北京索莱宝)；qRT-PCR实验所需试剂盒(大连宝生物)；蛋白质印迹实验所需抗体(英国Abcam公司)；引物序列、miR-335-5p 模拟物(mimcs)和抑制剂(anti-miR-335-5p)、模拟对照序列(miR-NC)和抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)(均上海生工)。

1.2细胞的分组和处理：取6孔板，加200μL(5.0×104个/mL)的MH7A细胞悬液。培养4h后，用含0、0.5、1.0、2.0mg/mL三七总皂苷培养24h，记为对照(Con)组、三七总皂苷低、中、高剂量组；转染miR-335-5p mimics、miR-NC、anti-miR-335-5p或anti-miR-NC，具体转染步骤参照LipofectamineTM 2000试剂盒，转染12h。转染miR-335-5p mimics、miR-NC的细胞，记为miR-335-5p组、miR-NC组；转染anti-miR-335-5p、anti-miR-NC的细胞均按照PNS-H组处理，记为PNS+anti-miR-335-5p组、PNS+anti-miR-NC组。

1.3CCK-8法检测细胞增殖抑制率：取各组细胞，培养48h后加CCK-8(10μL/孔)，孵育2h后，用酶标仪(波长450 nm)检测各吸光度(A)值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡：按照上述1.2.1分组处理24h，收集各组细胞。经PBS清洗后，加500μL Binding Buffer，重悬细胞。加10μL Annexin V-FITC、5μL PI，避光孵育15min后，1h内于流式细胞仪测定细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=早期凋亡+晚期凋亡。

1.5划痕实验检测细胞迁移：取6孔板，加2.5mL(5.0×104个/mL)MH7A细胞悬液。培养4h后，弃培养液，于各孔底部划两条等间距的平行线，间距记为d0h，并用PBS清洗掉划痕间细胞。然后按照上述1.2.2分组处理24h后，再次测量细胞间距离，记为d24h。划痕愈合率(%)=(d0h-d24h)/d0h×100 %。

1.6Transwell实验检测细胞侵袭：取6孔板，加2.5mL(5.0×104个/mL)MH7A细胞悬液。培养4h后，弃培养液，按照上述1.2.1分组处理24h，收集细胞，并调整细胞为5.0×105个/mL。将Transwell小室上室铺Matrigel基质胶，自然晾干。取100μL各组细胞悬液加至上室，加500μL完全培养液加至下室。培养24h后，弃培养液，用多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，显微镜观察，计数。

1.7蛋白质印迹法检测Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达：处理结束后，收集细胞。将细胞中总蛋白用RIPA试剂进行提取，并检测蛋白浓度(BCA法)。行SDS-PAGE实验分离总蛋白，转至PVDF膜，进行封闭处理(5%脱脂奶粉孵育2h)。于4℃中分别用Ki-67(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)、GAPDH(内参，1∶1 000)一抗孵育过夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室温下孵育1h。加显影液显影，曝光拍照，ImageJ软件分析蛋白条带吸光度值。

1.8qRT-PCR检测miR-335-5p表达：细胞接种和处理同上述1.2.1，用miRNA提取试剂盒对细胞中总RNA进行提取，并反转录为cDNA，进行扩增。引物序列：miR-335-5p上游5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，下游5'-TGCTTCAAGAGCAATAACGA-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。2-△△Ct法计算miR-335-5p相对U6的表达量。

2 结 果

2.1PNS对MH7A细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响：与对照组比较，PNS各剂量组细胞A值、细胞中Ki-67和PCNA蛋白的表达量均降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图1、表1。

图1 PNS对MH7A细胞凋亡和增殖相关蛋白表达的影响A：PNS对MH7A细胞凋亡的影响；B：PNS对MH7A细胞增殖相关蛋白表达的影响

表1 PNS对MH7A细胞增殖凋亡及相关蛋白表达的影响

2.2PNS对MH7A细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响：与对照组比较，PNS各剂量组细胞划痕愈合率、侵袭数及细胞中N-cadherin蛋白的表达量均降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白的表达量升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图2、表2。

表2 PNS对MH7A细胞迁移侵袭及相关蛋白表达的影响

图2 PNS对MH7A细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响A：PNS对MH7A细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响；B：PNS对MH7A细胞迁移的影响；C：PNS对MH7A细胞侵袭的影响

2.3PNS对MH7A细胞miR-335-5p表达的影响：与对照组比较，PNS各剂量组细胞中miR-335-5p的表达量均升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表3。

表3 PNS对MH7A细胞中miR-335-5p表达的影响

2.4上调miR-335-5p对MH7A细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响：miR-335-5p在转染miR-335-5p mimics的MH7A细胞中的表达量高于转染miR-NC的MH7A细胞(3.12±0.24 vs 1.00±0.00，t=26.500，P<0.05)。miR-335-5p组MH7A细胞A值、划痕愈合率、侵袭数及细胞中Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白的表达量均低于miR-NC组(P<0.05)，凋亡率、E-cadherin蛋白表达量高于miR-NC组(P<0.05)。见图3、表4。

图3 上调miR-335-5p对MH7A细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响A：上调miR-335-5p对MH7A细胞相关蛋白表达的影响；B：上调miR-335-5p对MH7A细胞凋亡的影响；C：上调miR-335-5p对MH7A细胞迁移的影响；C：上调miR-335-5p对MH7A细胞侵袭的影响

表4 上调miR-335-5p对MH7A细胞增殖凋亡迁移侵袭及相关蛋白表达的影响

2.5下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的作用：转染anti-miR-335-5p至MH7A细胞后期表达量低于转染anti-miR-NC至MH7A细胞(0.34±0.03 vs 1.00±0.00，t=66.000，P<0.05)。PNS+anti-miR-335-5p组MH7A细胞A值、划痕愈合率、侵袭数及细胞中Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白的表达量均高于PNS+anti-miR-NC组(P<0.05)，凋亡率、E-cadherin蛋白表达量低于PNS+anti-miR-NC组(P<0.05)。见图4、表5。

表5 下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞增殖凋亡迁移和侵袭的作用

图4 下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的作用A：下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞相关蛋白表达的作用；B：下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞凋亡的作用；C：下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞迁移的作用；D：下调miR-335-5p逆转PNS对MH7A细胞侵袭的作用

3 讨 论

三七，又被成为田七，是中国传统中药材之一，PNS是三七的主要活性成分，对多种肿瘤具有抑制作用。研究显示，PNS可通过上调E-cadherin及下调纤维连接蛋白、波形蛋白的表达抑制肺癌细胞上皮间质转化[4]；PNS可通过抑制VEGF/PI3K/AKT信号通路阻碍子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖和侵袭，且促进细胞凋亡，发挥抗子宫内膜癌作用[5]。Ki-67、PCNA是细胞增殖相关蛋白，与细胞增殖密切相关，本研究结果发现，PNS降低MH7A细胞增殖活性、增殖标志性蛋白(Ki-67、PCNA)表达及细胞迁移及侵袭，同时促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性，这提示PNS有可能对治疗RA具有积极作用。上皮间质转化是细胞获得迁移及侵袭的重要过程，在此过程中，上皮标志物E-cadherin表达减少，而间质标志物N-cadherin表达增加。本研究显示，PNS促进MH7A细胞中E-cadherin蛋白表达，而抑制N-cadherin蛋白表达，提示PNS可能通过间接抑制MH7A细胞上皮间质转化来阻碍细胞迁移和侵袭。

MiRNA可参与RA在内的多种疾病发生发展，可作为疾病治疗的分子靶点。目前miR-335-5p的研究多集中在肿瘤方面，如miR-335-5p在乳腺癌[6]、卵巢癌[7]和结直肠癌[8]等多种癌症中表达下调，上调miR-335-5p可发挥抑癌基因作用阻碍这些肿瘤的发展进程。RASF也具有肿瘤细胞特性，本研究发现，上调miR-335-5p降低细胞增殖活性、划痕愈合率、侵袭数，Ki-67、PCNA、N-cadherin蛋白表达，并增加凋亡率、E-cadherin蛋白表达量，提示上调miR-335-5p对MH7A细胞增殖、迁移及侵袭具有显著抑制作用，而对细胞凋亡起促进作用，这与结果[3]报道一致，提示miR-335-5p可作为抑制RA发生发展的分子靶点。本实验显示，PNS可呈剂量依赖性上调MH7A细胞中miR-335-5p的表达，而恢复实验结果表明，下调miR-335-5p逆转了PNS对MH7A细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的作用，这提示PNS可能通过上调miR-335-5p来发挥对MH7A细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的作用。

但PNS上调miR-335-5p是通过何种途径或分子发挥抗RA作用的还有待进一步探究。在先前的研究中，miR-335-5p被报道可通过靶向下调其靶基因SDC1[6]、BCL2L2[7]、LDHB[8]的表达而发挥作用。BCL2L2已被证实在RASF系MH7A细胞中表达升高，靶向下调BCL2L2表达具有抗RA作用[9]；SDC1也被认为是与RA发展相关的中枢基因[10]；LDHB与RA炎症性疾病活动度有关[11]。在后续的研究中，将对miR-335-5p发挥抗RA作用的下游靶基因进行深入分析。综上，PNS抑制RASF细胞系MH7A增殖、侵袭和迁移，促进凋亡，其作用机制可能与增加miR-335-5p的表达有关。