碘伏对金属钛合金板表面金黄色葡萄球菌的抗菌实验研究

耿玮峥,李子豪,张 昊,马壮壮,陈 伟

(吉林大学中日联谊医院 骨科,吉林 长春130033)

人工关节作为金属内植物材料广泛应用于关节外科领域，取得了良好的临床效果，但同时人工关节置换后易出现感染，据文献报道[1]，假体周围感染的发生均是由细菌感染引发的，而术中细菌直接种植是感染的最直接因素，约占全部感染的57.9%，处理颇为棘手，治疗上需要进行反复的清创，移除假体，其主要原因就是由于细菌生物膜(BBF)的形成。由于抗生素对于BBF的渗透非常困难，传统的抗生素治疗无论是单独还是联合使用都不能有效清除细菌，甚至还会导致耐药性的产生。因此在目前情况下，预防感染就显得尤为重要。碘伏(聚维酮碘)溶液作为一种常见的抗菌剂，已经广泛应用于关节手术中的局部冲洗、浸泡，尽管临床实践中在预防关节周围感染效果显著，但缺乏相关的基础研究，临床指南及使用标准。由于人工关节材料中广泛存在钛合金，金黄色葡萄球菌(SA)是关节感染最常见的致病细菌，本研究通过观察聚维酮碘溶液在钛板表面未完全形成BBF时，冲洗浸泡后的灭菌效果，为临床在术后关闭切口前，对碘伏清除细菌的效果提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

钛合金板，由中国天津IRENE正天医疗器械厂家加工并提供;金黄色葡萄球菌(SA)，中日联谊医院检验科提供，聚维酮碘皮肤消毒液(上海利康高科技有限公司)；37℃恒温培养箱(北京医疗设备厂);胰蛋白胨的稀释液(TPS)，磷酸盐缓冲液等。

1.2 实验分组与方法

1.2.1建立3组实验样本 (1)无菌清洁钛合金板组：经过高温高压消毒的钛合金板。(2)碘伏浸泡钛合金板组：沾染上微量金黄色葡萄球菌，但经碘伏冲洗浸泡后的钛合金板。(3)无菌盐水冲洗钛合金板组：沾染上微量金黄色葡萄球菌，但经无菌生理盐水反复冲洗后的钛合金板。

1.2.2实验方法 (1)细菌悬液的制备:试验菌选择金黄色葡萄球菌(ATCC6538),放入 37℃培养箱中，新鲜斜面培养24 h后取出,经显微镜下确认清楚后，用含胰蛋白胨的稀释液(TPS)冲洗下菌苔，并制备成菌悬液。再用含 30 g/L牛血清白蛋白溶液作为稀释配制试剂，配置成极低浓度的菌悬液(含1-2个细菌/0.25 ml)备用。(2)钛合金表面细菌沾染样本制备:将钛合金盘进行清洁、干燥、包装、灭菌等预处理后备用，在百级手术室内取3组无菌清洁钛合金板，放入无菌24 孔板中。第一组设为无菌清洁钛合金板，在百级手术间内将无菌包装打开，置于无菌24孔板中，滴入无菌盐水1 ml放置；第二组设为碘伏浸泡钛合金板组，将无菌包装打开，置于无菌24 孔板中，外露在百级手术间内，同时用制备好的菌悬液1 ml滴入表面，分别在无菌条件下，用碘伏分别在15 min，30 min，60 min，90 min时浸泡冲洗1 min；第3组设为无菌盐水冲洗钛合金板组，将无菌包装打开，置于无菌24 孔板中充分暴露，同时用制备好的菌悬液1 ml滴入表面，在无菌条件下，用无菌生理盐水分别在15 min，30 min，60 min，90 min时反复冲洗1 min。(3)悬液细菌定量测定：用 PBS将每枚钛板冲洗3次，使表面未粘附的细菌脱落，并用超声裂解、振荡等方法使钛合金板表面细菌基本脱落，再次收集。稀释加入装有 4.5 ml冲洗液的无菌试管中,混匀。中和 10 min,取样液进行活菌计数，试验重复3次。

1.3 统计学分析

2 实验结果

通过实验发现，金黄色葡萄球菌能够附着在金属钛板上存活，繁殖，经统计：无菌盐水冲洗钛板组活菌率约85%，碘伏浸泡钛板组活菌率约1%，无菌清洁钛板组活菌率95%以上，统计学意义显著(P<0.05)，见表1。

表1 细菌活菌率统计表

无菌清洁钛板组随着时间的延长，有细菌在其表面沾染，碘伏浸泡钛板组经过碘伏的冲洗浸泡几乎无细菌存活，而无菌盐水冲洗钛板组随着时间的延长，细菌开始出现指数生长情况，见表2。

表2 细菌计数(高倍显微镜下，每视野)统计表

3 讨论

3.1 碘伏对附着在金属表面细菌作用的影响

关于文献选取，通过检索维普网、中国知网、万方数据库、PubMed、CNKI全文数据库等国内外数据库，收集关于碘伏对于钛合金材料的相关性研究。检索词包括：碘伏术后抗菌应用、金黄色葡萄球菌感染、骨关节术后感染、钛合金材料抗菌应用、iodophor、Bone OR等。再通过关键词及文献摘要排除明显不符合的文章后，根据筛选标准包括：①金黄色葡萄球菌对钛合金表面影响的研究②碘伏对钛合金表面看抗菌效果的研究③骨关节术后感染的并发症的探讨等。排除标准包括：①与钛合金材料抗菌无关的文献②内容陈旧，观点仍存在广泛争议的文献等。我们不难发现，细菌一般初始以浮游状态沾染被污染区域，数小时致数日完成在假体，骨界面，组织等区域的定植。随着浮游细菌吸附于假体表面，通过相互粘连、包裹形成生物膜，有研究报道[2]生物膜内细菌与浮游分散状态相比，耐药性提高了10-1 000 倍。因此，污染持续时间越长，越不利于彻底清除细菌。碘伏对浮游菌有很强的杀灭作用，可以用来预防手术感染。但是对于已经形成的BBF，碘伏很难杀灭其中的细菌。Nakagawa[3]和Hoang[4]报道单纯应用碘伏溶液不能清除 BBF，这是因为BBF是细菌分泌的多糖、纤维蛋白和脂蛋白等物质粘附于生物材料形成的并能将细菌自身包裹于其中的膜样复合物，如关节假体表面发热膜状物质，BBF能增强细菌对外界刺激的耐受力及抗菌药物的耐药性。近年来，BBF对抗菌药物机枪的抵抗力也成为临床上难治性感染的重要原因之一。研究表明[5-6]在处理细菌污染创面时，特别是细菌沾染在关节假体上面，必须要及时处理才能控制细菌的污染，防止感染的发生。因此，在目前的阶段下，提前预防，积极预防，主动预防应该是防止人工关节周围感染发生的最佳方式，手术中关闭创口的时候，再次清理灭菌就显得格外重要[7]。此次研究表明，90 min内沾染在金属表面的细菌，应用碘伏进行浸泡和冲洗，能够将浮游和沾染在金属表面的细菌完全消灭。

3.2 冲洗液对附着金属表面细菌的作用

手术冲洗对预防术后感染非常重要，研究表明[8]冲洗可以大大减少创口受到可能存在污染区域的细菌数量，还可以清除手术创口内失去血供容易成为细菌的良好培养基的组织碎屑，导致机体发热凝血块，同时冲洗可以增加手术部位的组织局部抵抗力，减少炎性反应，达到降低感染的目的。但对于人工关节置换手术的创口来讲，存在人工金属材料，细菌往往会沾染或黏附在表面，如不及时清理，将逐渐形成BBF，是人工关节置换手术后关节感染难以治愈的原因。如金黄色葡萄球菌是人工关节置换最主要的致病菌，生物膜将保护细菌面对抗生素，机体免疫及杀菌剂的攻击。大量文献表明[9-11]当细菌处于浮游状态时，冲洗将起到积极作用。我们知道在手术过程中，尽管是无菌操作，但经过数小时开放性手术操作，很难避免空气中的细菌沾染或术中不经意直接沾染都有可能造成术区的污染，而冲洗将是我们在关闭切口前的最后抗菌措施，能否有效避免伤口污染发展为感染,何种冲洗液预防感染的效果好一直是外科医生需要深入研究的问题。李晓华等[12]研究表明，当细菌进入创口与假体接触后，会在假体表面产生一种细胞外多黏质物质(extracellular slime substance，ESS)，当细菌处在游离状态沾染在假体表面时，冲洗就显得很重要，它可以破坏沾染在假体表面的 ESS，从而可以达到清除细菌的目的。目前常用术区冲洗液包括：生理盐水，高渗盐水，抗生素生理盐水冲洗液，化学试剂(包括碘伏，过氧化氢)等，但能够在最后关闭手术切口前确切彻底杀灭和清除细菌的冲洗液不多，研究发现[13]高渗盐水，生理盐水，抗生素盐水，过氧化氢都可以清洗掉和杀灭大部分沾染的细菌，但很难能达到彻底灭菌的功能，存在污染的风险。研究表明[14]碘伏依靠其氧化和碘化菌体内巯基化合物、肽类和蛋白质可完全杀灭细菌，而对于碘伏能否彻底杀灭附着在内植入金属材料细菌缺乏了解，我们此次进行的对比试验表明，碘伏溶液通过浸泡具有杀灭附着在金属表面的金黄色葡萄球菌的能力，即使细菌仍沾染在金属表面，也能够被杀灭，可以消除污染的隐患。我们可以通过统计结果发现，在污染的钛合金表面，应用碘伏浸泡和冲洗后，即使90 min后仍然保持无污染或极低沾染状态，而生理盐水冲洗组已经发生污染，每个阶段的冲洗能够减少和控制细菌的数量，但不能控制残留细菌的繁殖，金黄色葡萄球菌开始成指数生长，且无法彻底清除金属表面残留的细菌。而无菌钛板组，在暴露的手术室环境中，长时间也出现细菌沾染情况。这些都表明，能否有效杀灭细菌冲洗和浸泡是防治感染的关键。

4 文章的局限性

①骨科术后感染的菌种非常丰富，本文仅对最为常见之一的金黄色葡萄球菌进行了研究，存在单一性；②我们未对现实中临床病例中抗菌效果进行病例调查、研究，也未对患者进行随访。③临床中我们碘伏浓度还有多种，其是否对金黄色葡萄球菌具有更好的影响还有待于进一步探究。不过随着医学科研的不断进步以及医疗水平的提高，碘伏(聚维酮碘)的作用及应用一定会在相关领域被进一步验证。