1株多谱系毒株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定和遗传变异分析

王新东，张 康,庞燕丽，黄稳妃，莫清荣，黄 静，陈 樱,欧阳康,黄伟坚，韦祖樟*

(1广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2 广西农业职业技术大学,动物科学技术系，广西 南宁 530007)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种危害全球养猪业的重要传染病。该病于1987年首次在美国发现，临床表现为母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病，随后相继在欧洲、亚洲等养猪生产国暴发，给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失[1]。PRRSV是一种单股正链、不分节段的RNA病毒，其基因组包括至少10个开放阅读框(open reading frame,ORF)，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7；其中，ORF-1a和ORF1b基因分别编码nsp1α、nsp1β、nsp2～nsp6、nsp7α、nsp7β和nsp8～nsp12等至少14种非结构蛋白(non-structural proteins,nsps)，ORF2～ORF7基因分别编码GP2a、E、GP3、GP4、ORF5a、GP5、M和N等8个病毒结构蛋白[2]。PRRSV基因组存在高度的变异，nsp2和ORF5是基因组变异程度相对较高的区域之一；nsp2可容纳不同长度的氨基酸的缺失和插入，被认为是PRRSV基因组中可塑性最高的区域，许多研究基于该区域开发了各种标记的重组病毒[3-4]；ORF5基因所编码的GP5蛋白是PRRSV主要的中和抗原和结构蛋白之一，其良好的免疫原性能够诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，是研制PRRSV基因工程疫苗的首要考虑区域之一[5-6]；在很大程度上，nsp2和ORF5基因都可以反映PRRSV基因组的遗传变异特征，故常以此作为靶基因来研究不同亚型的PRRSV。

迄今为止，已经在世界范围内鉴定了2种不同基因型PRRSV，即PRRSV 1型(欧洲起源，代表毒株lelystad-virus，LV)和PRRSV 2型(北美起源，代表毒株VR-2332)[7]。2种基因型有60%左右的相似性，两者之间的差异较大。SHI等[8]基于ORF5基因的系统发育分析将PRRSV 2型进一步划分为至少9个谱系(lineage)，我国目前主要流行谱系1(NADC30-like)PRRSV、谱系3(QYYZ-like)PRRSV、谱系5(VR2332-like)PRRSV和谱系8(HP-PRRSV-like) PRRSV等4个谱系。近年来，在原本谱系8 PRRSV主要流行的中国部分地区，谱系1和谱系3的PRRSV逐渐呈现出流行的趋势[9]。除此之外，越来越多的研究表明，不同亚型的PRRSV毒株能够在常用于分型的靶基因(nsp2和ORF5)区域发生重组事件[10]，造成了毒株亚型的混淆和难以鉴别，而基于全基因组的遗传分析能更加准确地了解和判断PRRSV的类型以及生物学特征，有利于其他研究的开展。

本研究从2020年广西贵港地区采集的疑似感染PRRSV的病料样本中检测鉴定到1株PRRSV，将其命名为GXGG202007；进一步在Marc-145细胞上进行了病毒分离，经过RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定后，对其全基因组序列进行了测定；运用Mega7.0、RDP5.3以及Simplot3.5.1等生物信息学软件分析了该毒株的基因组特征和遗传重组模式，研究结果丰富了PRRSV在广西地区遗传多样性和重组模式上的流行病学数据，为PRRSV的防控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 病料的来源与主要试剂病料样品为广西贵港地区某疑似暴发PRRS猪场送检的发病猪肺脏组织；试验所用的RNA抽提试剂盒购自百赛生物公司；PCR用预混酶购自TaKaRa公司和Vazyme公司；RNase Inhibitor、dNTP Mixture、反转录酶 M-MLV、pMD18-T、DNA Marker购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DH5α感受态细胞购自康为有限公司；MEM培养基购自BI公司；胎牛血清购自Gbico公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自全式金公司；非洲绿猴肾细胞(Marc-145)、PRRSV N蛋白的特异性单抗(SDOW-17A)由本实验室保存。

1.2 引物信息根据PRRSV基因组的保守区域设计了1对用于扩增鉴定的特异性引物，上游引物为ORF5-F:5′-AGGTGGGCAACCGTTTTA-3′，下游引物为ORF5-R:5′-GCAGGGGCCAGAATGTACTTG -3′，扩增产物片段大小986 bp；反应条件为95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最终72℃延伸7 min。扩增病毒全基因组的引物主要来源于参考文献[11]；上述引物均由上海生工生物有限公司进行合成。

1.3 病毒的检测与分离将病料组织加入适量的PBS研磨处理，研磨液12 000×g离心5 min后用直径0.22 μL的滤器过滤，抽提病毒RNA并反转录为cDNA，使用特异性的引物进行RT-PCR检测鉴定。将检测得到的阳性样品2倍稀释后，取200 μL接种于贴壁良好的PAM细胞，在37℃、5%CO2培养箱孵育1 h后，用PBS洗2遍，然后加入2% MEM培养基继续培养2～3 d，在48或72 h后收获上清，盲传3代；经过RT-PCR和IFA鉴定后，进一步在Marc-145细胞上进行分离，待Marc-145细胞在六孔板中长满70%左右接毒，后观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)。当CPE达80%时，收获上清，-80℃冻存。

1.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定将感染48 h后的Marc-145细胞用冰甲醇固定10 min，1%BSA封闭30 min，用SDOW-17A作为一抗37℃ 孵育2 h，然后用FITC标记羊抗鼠的二抗37℃ 孵育1 h，PBS洗5遍后，在荧光倒置显微镜下观察结果并拍照。

1.5 全基因组序列的扩增抽提1.3中的病毒核酸并反转录为cDNA，利用8对特异性引物[11]经PCR分段扩增病毒基因组，反应条件为95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；最终72℃延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段纯化回收后，连接到pMD18-T上，由北京华大基因生物技术有限公司测序。

1.6 遗传演化及同源性分析使用MEGA7.0软件对GXGG202007毒株与参考毒株(表1)进行遗传演化分析。利用DNAStar软件中MegAlign程序对GXGG202007毒株同参考毒株的各基因区域的核苷酸与推导的氨基酸序列进行比对和相似性分析。

表1 参考毒株信息

1.7 重组分析使用RDP5.3和SimPlot3.5.1软件对GXGG202007进行重组分析。

2 结果

2.1 病毒的分离和鉴定利用合成的PRRSV ORF5特异性引物对发病猪的组织进行RT-PCR扩增，将扩增产物进行测序确定PRRSV阳性。为了从病料中分离出PRRSV，将PRRSV阳性病料接种于状态良好的Marc-145细胞中，盲传3代并观察是否出现CPE，最后经过抽提RT-PCR和IFA鉴定。结果显示：GXGG202007分离株在Marc-145细胞上能够产生典型CPE (图1)，并且经抽提RT-PCR能检测到PRRSV的存在。将出现CPE的细胞固定，用PRRSV N蛋白单克隆抗体进行IFA试验检测PRRSV N蛋白的表达，结果显示病料接种细胞有明显的特异性绿色荧光(图1)，而阴性对照组未呈现绿色荧光，说明了该毒株能在Marc-145细胞上复制，将所分离的PRRSV毒株命名为GXG-G202007。

图1 PRRSV分离株感染Marc-145细胞48 h后的CPE与IFA

2.2 全基因组扩增和遗传演化分析利用所合成的8对特异性引物对分离毒株GXGG202007基因组进行分段扩增。将测序结果用SeqMan软件进行拼接与校正，最后获得该毒株的全基因组序列并上传到基因库(GenBank)，获得序列号为：OL439476。除poly(A)尾外，该毒株的基因组核苷酸长度为15 517 bp。

运用Mega7.0软件中的邻位法基于1 000次重复次数分别构建了nsp2基因(图2A)、ORF5基因(图2B)以及全基因组序列的遗传进化树(图2C),结果显示：在构建的3个演化发育树中，PRRSV毒株可分为2个基因型，以LV为代表的欧洲型和以VR-2332为代表的美洲型，我国2型PRRSV又主要分为4个谱系(Lineage 1、Lineage 3、Lineage 5和Lineage 8)。GXGG202007毒株在3种不同的系统发育树中与毒株QYYZ、GM2、GD-KP同属于Lineage 3，证明该毒株属于QYYZ-like亚群。

A.基于nsp2基因构建的系统发育树；B.基于ORF5基因构建的系统发育树；C.基于全基因组序列构建的系统发育树

2.3 GXGG202007毒株的同源性分析从GenBank中下载的国内外代表毒株序列，利用 MegAlign(Clustal W)进行 nt 的同源性分析；如表2中显示，GXGG202007与QYYZ毒株的相似性最高，为91.4%，其次是同一谱系的重组毒株GD-KP和GM2，相似性分别为89.6%,90.6%；与我国分离的NADC30-like毒株CHsx1401的相似性为81.7%；与我国JXA1、HuN4毒株的相似性分别为86.7%,86.8%；与北美代表毒株VR2332、我国经典毒株CH-1a的相似性分别是85.5%,86.9%；与欧洲型代表毒株Lelystad virus相似性为60.3%；说明了分离毒株在亲缘关系上同北美型PRRSV毒株较近。

在全基因同源性分析的基础上，进一步将GXGG202007毒株基因组的每个区域与参考毒株的相同区域进行核苷酸和氨基酸相似性比较(表2)，GXGG202007毒株在nsp2～nsp7区域的核苷酸和氨基酸分别为88.9%～97.9%和85.0%～100.0%，在nsp10～ORF2区域的核苷酸和氨基酸分别为92.3%～96.7%和90.8%～98.4%，在ORF4～6区域的核苷酸和氨基酸分别为88.5%～94.2%和89.4%～97.7%，这3部分连续区域都与QYYZ毒株具有较高的一致性；但在5′UTR的核苷酸和nsp1区域的核苷酸和氨基酸与谱系8的JXA1毒株有更高的一致性，分别为95.5%,92.7%和91.4%。不仅如此，在nsp8～nsp9、ORF3～ORF4、ORF7三个连续区域，又显示出同CH-1a毒株(nsp8和ORF7区域)和VR2332毒株(nsp9和ORF3区域)具有更高的核苷酸和氨基酸一致性。以上的序列比较结果说明，GXGG202007很可能存在多个毒株间重组的现象。

表2 GXGG202007与代表性PRRSV在基因组不同 区域的核苷酸和氨基酸的相似性比较 %

2.4 GXGG202007毒株的重组分析为了解GXGG202007的重组情况，使用了RDP5软件进行重组分析；为确定真实可靠的重组事件，选取了从至少5种检测方法结果中具有非常高的确定度(P值 ≤1×10-6)区域进行分析；根据RDP5的检测图谱显示，GXGG202007与HP-PRRSV-like毒株10-10HB-3以及RespPRRS MLV-like毒株之间可能存在4个潜在的重组事件，在P值成立的情况下确立了这4个重组区域，重组位点分别位于42～2 008,6 884～8 549,8 550～9 523和13 061～13 853 nt 处(表3)；进一步通过Simplot软件沿着基因组比对的200 bp滑动窗口(步长为20 bp)进行相似性比较确定重组事件(图3A)，绘制的图谱显示基因组可被分为7个部分(图3A，a～g)，重组片段分布于参考毒株基因组(图3B)的5′UTR-nsp2、nsp8～nsp9以及ORF3～4区域，与RDP5检测的重组事件基本一致。结合RDP5及Simplot3.5.1的分析结果构建不同区域的发育树(图3C)，大致确定了3个重组断点区域，分别位于GXGG202007毒株基因组的nsp2(2 008 nt)、nsp9(8 550 nt)和ORF3(13 061 nt)中。综上，重组分析结果表明GXGG-202007是1个以QYYZ毒株为母本，同时由HP-PRRSV-like毒株以及VR-2332-like毒株提供重组片段的3个谱系毒株重组的产物；值得注意的是，该毒株在nsp2区域的主要亲本为GM2毒株，并且在nsp9区域与GM2毒株具有相似的重组模式，很有可能是与GM2相关的毒株在田间进一步重组并演化的结果。

表3 RPD5软件检测到PRRSV病毒分离株GXGG202007重组事件的信息

A.GXGG202007毒株基于simplot软件绘制的基因组相似图；B.参考QYYZ毒株基因组的位置示意图；C.基于GXGG202007毒株不同区域序列构建的系统发育树

3 讨论

PRRS是世界养猪业中的重大传染病之一，其病原体PRRSV的迅速变异和演化加剧了该病的预防和控制难度。近年来，在不同亚型的PRRSV中陆续发现了不同程度的变异以及丰富的重组模式[13]；重组对病毒多样性和进化有巨大的影响，不仅会导致 PRRSV新亚型的产生，而且与毒力和致病性的上升、细胞和组织嗜性的改变、宿主免疫力的逃避产生有关；但是，目前对发生重组的具体机制尚不明朗。

本试验从广西贵港地区采集的疑似感染PRRSV的病料样本中检测分离到了1株在多基因演化树中归属于谱系3的PRRSV毒株；通过序列的相似性比较，发现在该毒株的 5′UTR与nsp1区域和ORF3区域，分别与HP-PRRSV-like毒株和VR2332-like毒株有着更高的一致性。综合多种生物信息学分析，结果显示该毒株的重组模式复杂，可能存在4个重组事件；在此基础上，通过不同区域的系统演化分析，判断该毒株的重组断点位于基因组的nsp2、nsp9和ORF3中，证明其是一株以谱系3代表毒株QYYZ为骨架，谱系8和谱系5毒株提供重组片段的多谱系重组毒株。

自谱系3 PRRSV进入我国后，该亚型毒株存在广泛的变异和重组。早在2010年报道出现1种MLV Resp PRRS疫苗株与田间野毒QYZZ发生自然重组的新型毒株，被命名为GM2，该毒株的重组片段包含完整的nsp9和nsp10编码区，重组后增加了亲本毒株的致病性[14]。随后，一系列与QYYZ相关的重组毒株(如GDsg、SH1211、ZJnb16-2、SD110-1608、SCcd16和SCya17、GD1404、FJFS等)在中国浙江、山东、河南、四川、福建、江西等多个省份被发现[12,15-18]；2015年，中国西北部的新疆地区也报道了QYYZ重组毒株的存在[10]；2017年，QYYZ-like毒株一度在我国福建省发生了小规模的流行，甚至出现了3个或4个谱系重组的PRRSV毒株[19]。目前，临床上正在使用的商业化疫苗对QYYZ-like毒株缺乏完全有效的免疫保护作用，容易导致QYYZ-like毒株不断地与疫苗毒株或其他谱系毒株发生重组，以产生适应极端环境的PRRSV重组新变种，进一步加深了PRRSV的种群复杂程度；因此，分离和了解临床上流行的QYYZ-like毒株存在一定的研究应用价值。

GXGG202007毒株的全基因组特征以及呈现出的重组模式丰富了PRRSV在遗传多样性和重组模式研究的数据，为今后PRRSV的防控和疫苗的研制提供了一定的参考。