慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接的影响

张思淼,薛琳琳,周文凯,胡惠洁,徐 彬,郭景茹*

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江职业学院，黑龙江 哈尔滨 150111)

我国寒冷地区覆盖面积辽阔，冬季寒冷漫长，降雪量大，温度一直维持在较低的水平，例如我国东北、华北、西北等地区的冬季和高纬度地区的环境温度可以达到0℃之下，少数地区可达到-30℃之下，据查全国各个地区80%的畜禽养殖场畜舍都是开放式或半开放式，因而目前在我国的大部分寒冷地区都可能面临畜禽处于冷暴露环境的威胁。冷暴露对畜禽养殖造成了许多不利影响，如采食量增加、基础代谢率增加、能量损失增加、动物免疫力降低等[1]造成畜禽生产性能下降，给畜牧行业带来了巨大的损失。若对畜禽的防护措施欠妥或者不及时，致使畜禽长期处于冷暴露环境中，可引起机体氧化，增加自由基含量，对动物机体内脏器造成损伤，例如肺水肿、肝水肿、肠道出血等，并且诱导生理学、行为学和免疫学的变化[2]。研究发现，大鼠在-20℃ 的环境冷暴露5 min就会导致肝脏水肿；大鼠-8℃冷暴露4 h会耗尽肝脏糖原，造成肝脏损伤；冷暴露后雏鸡十二指肠出现不同程度的充血和出血[3-5]。而肠道是保护机体的第一道防线。肠道分为十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠，其中结肠可以吸收水、Na+、Cl-和短链脂肪酸，分解K+和碳氢化合物，保持机体水分平衡从而防止机体脱水，而且结肠中具有种类丰富的微生物，这些微生物可以防止致病菌的定植和生长[6]。结肠存在着四大屏障：机械、化学、生物和免疫屏障，其中机械屏障主要是由黏液层、结肠上皮细胞和紧密连接等构成。结肠上皮细胞作为机械屏障的主要结构之一，其直接与大量微生物和有毒物质等持续接触，大量研究结果表明，结肠的机械屏障功能与多种肠道疾病的发病机制有关，例如克罗恩病，克罗恩病患者的肠道与健康肠道相比通透性明显增加[7]。而紧密连接是由跨膜蛋白、支架蛋白和调节分子组成的复合物[8]，其对维持机械屏障的完整性和肠上皮正常生理功能发挥至关重要的作用。紧密连接通过调节水、离子和其他溶质的通过来控制细胞旁通透性，还可通过阻断基底外侧膜的脂质和蛋白质等营养物质的自由扩散，从而维持细胞极性[9]。紧密连接被破坏会间接引起致病菌和内毒素的移位，继而导致肠道屏障功能受损[10]。因为结肠上皮细胞的紧密连接可抑制细菌黏附、防止肠源性感染，所以结肠上皮细胞的紧密连接对畜禽肠道健康极其重要，且根据肠道解剖学特点可知，肠道很容易受到冷暴露的影响，目前关于慢性冷暴露对小鼠结肠的影响报道较少。本试验采用了苏木精-伊红(HE)染色法观察冷暴露后小鼠结肠形态学的变化，利用免疫荧光技术观察冷暴露后小鼠结肠组织中带状闭合蛋白-1(ZO-1)的定位情况和应用蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测了冷暴露后小鼠结肠组织中紧密连接相关蛋白中闭合蛋白-1(Claudin-1)、咬合蛋白(Occludin)、ZO-1和炎症因子中白细胞介素-1β(IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达情况，以探究慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组5周龄C57BL/6雄性小鼠(体质量为22～24 g)在人工智能气候室中(24±2)℃，40%相对湿度，明/暗：12/12 h自由饮水进食。预饲1周后的小鼠随机分为对照组和冷暴露组。冷暴露组的小鼠置于4℃、湿度为40%的环境中每天暴露3 h，连续刺激3周，其余时间置于室温环境。对照组小鼠始终置于室温环境中饲养。在冷暴露周期结束后，根据试验要求对2组动物安乐死后再将小鼠的结肠组织进行分离和采集，用于后续试验。

1.2 主要仪器人工智能气候室购于济南徐邦电子科技有限公司；电泳槽、转印仪、化学发光成像系统购于Bio-Rad；脱色摇床购于中国其林贝尔公司；酶标仪购于迈瑞医疗国际股份有限公司；激光共聚焦显微镜、冰冻切片机购于Leica。

1.3 主要试剂BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试盒、多聚甲醛购于碧云天生物技术有限公司；ZO-1、Claudin-1、Occludin、IL-1β、iNOS、TNF-α一抗、HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗、CoraLite488偶联的ZO-1多克隆抗体、羊抗兔绿色荧光二抗购于Proteintech。

1.4 HE染色取约1 cm新鲜结肠组织，用4%的多聚甲醛进行固定，经过脱水、石蜡包埋、切片、烘干、染色、盖片和封片等步骤制作切片，最后使用显微镜进行观察小鼠结肠组织的形态学变化。

1.5 免疫荧光染色将对照组和冷暴露组小鼠的结肠组织利用4%多聚甲醛固定，制备组织切片后，使用封闭液进行封闭。一抗二抗避光孵育后封边，最后利用激光共聚焦显微镜检测ZO-1在结肠组织中的表达和定位。其中绿色荧光为ZO-1蛋白，蓝色荧光为细胞核。

1.6 Western blot将小鼠结肠组织研磨提取总蛋白，计算蛋白浓度。准备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照说明书配制分离胶和浓缩胶。组装电泳槽，将蛋白样品加入各孔，连接电泳仪器，常规电压50 V/30 min、80 V/30 min、120 V/30 min。根据所需要的目的条带分子质量切胶，裁剪匹配胶的PVDF膜，将“三明治”放在电转槽中，设置恒流250 mA，进行电转。用5%脱脂奶粉配制的封闭液对PVDF膜进行1 h的封闭。再用下列一抗孵育过夜：ZO-1、Claudin-1、Occludin、IL-1β、iNOS、TNF-α，β-actin作为内参。用洗涤缓冲液洗膜4次，根据蛋白说明书用1XTBST配置二抗，室温孵育1 h，用洗涤缓冲液洗膜4次。按照说明书配置显影液，先打开机器预热，将PVDF膜放入ChemiDocXRS+机器中，将显影液滴到PVDF膜上进行显影。使用Image Lab软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 结肠组织HE染色结果如图1所示，HE染色结果显示，与对照组相比冷暴露组皱襞消失。

A.对照组；B.冷暴露组

2.2 慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接蛋白表达量的影响如图2所示，与对照组相比冷暴露组紧密连接蛋白表达降低，其中Occludin显著下调(P<0.05)，Claudin-1和ZO-1呈现较低水平，且差异极显著(P<0.01，P<0.001)。

A.对照组与冷暴露组Claudin-1、Occludin和ZO-1表达量Western blot检测结果； B.Claudin-1的表达变化；C.Occludin的表达变化；D.ZO-1的表达变化；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.3 结肠组织ZO-1免疫荧光染色结果如图3所示，免疫荧光结果显示，与对照组相比冷暴露组ZO-1含量较少，分布松散。

图3 免疫荧光检测对照组和冷暴露组小鼠结肠组织ZO-1蛋白表达

2.4 慢性冷暴露对小鼠结肠炎症因子表达量的影响如图4所示，与对照组相比，冷暴露组小鼠的结肠炎症因子表达升高，其中iNOS和TNF-α的表达显著上调(P<0.05)，IL-1β的表达呈升高趋势，且差异极显著(P<0.01)。

A.对照组与冷暴露组TNF-α、IL-1β和iNOS表达量Western blot检测结果； B.TNF-α的表达变化；C.IL-1β的表达变化；D.iNOS的表达变化

3 讨论

冷暴露是我国常见的影响畜禽生长的环境因素之一。动物受冷暴露后机体的反应机理十分复杂。当畜禽持续处于冷暴露环境中，机体肾上腺皮质激素和儿茶酚胺增多，促进机体代谢，提高机体适应能力；长期处于冷暴露环境中，能量不断被消耗，部分机能被破坏，适应能力和抵抗能力下降，引起内环境失调，会损伤许多内脏器官，最后机体衰竭[11]。慢性冷暴露影响畜牧业经济发展，还对动物机体的健康和福利造成不良影响。故我们为探究冷暴露对小鼠结肠的影响，对慢性冷暴露后小鼠的结肠组织结构及相关蛋白表达量的变化进行研究。

虽然皮肤与外界环境接触最直接，但是黏膜联合面积远远大于皮肤。肠道的黏膜面积最大，与食糜、抗原和各种微生物持续接触，且结肠中富含多种微生物。因此，结肠是先天免疫和适应性免疫的关键部位。肠道皱襞增大的表面积，有利于肠道益生菌的的定植[12]。本试验HE染色显示与对照组相比冷暴露组小鼠结肠皱襞消失。这提示了冷暴露对小鼠结肠产生显著的影响，表面积减少可能会降低益生菌的定植，进而影响结肠的免疫屏障功能。研究表明，损伤紧密连接的结构完整性和功能会引发肠壁通透性增高，引发结肠炎的发生[13]。紧密连接封闭了细胞间隙，在肠道内的位置不同紧密连接对小分子通透能力有所不同[8]。紧密连接相关蛋白包括Claudin、Occludin、ZO蛋白家族等，Claudin蛋白家族是构成紧密连接，维持细胞之间连接并调节细胞内的离子流动所必需的蛋白之一；Occludin蛋白家族是膜蛋白的重要组成部分，主要参与肠壁通透性的调节；ZO蛋白与其他蛋白，如肌动蛋白及其相关蛋白相互作用形成一个坚实的框架以维持膜的完整性。研究表明，当ZO-1受损时或Occludin蛋白被水解，紧密连接结构被破坏，细胞旁途径通透性增高[14-16]。在本试验结果中发现，在冷暴露处理后小鼠结肠组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1的表达水平出现了显著下调，并且细胞间的紧密连接蛋白ZO-1结构被破坏、含量较少且分散分布。这些结果表明慢性冷暴露会导致小鼠结肠紧密连接受损，从而引发机体出现一系列的异常反应，形态上的变化皱襞消失。有研究表明，紧密连接受损，严重时还会引发细胞凋亡等[17]。

研究表明TNF-α是肠上皮屏障损伤的重要启动因子，TNF-α抑制ZO-1 mRNA的转录和Occludin启动子的表达，降低ZO-1和Occludin的表达，破坏肠道紧密连接的完整性使肠壁通透性增加[18-19]。推测紧密连接受损是否与炎症因子存在密切关系，采用Western blot技术进一步检测炎症因子TNF-α的表达，结果显示与对照组相比冷暴露组小鼠结肠TNF-α的表达量显著上调。而在MLCK途径中，TNF-α与肠上皮细胞表面肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)结合后，激活NF-κB进而增加IL-1β和TNF-α的转录，促进IL-1β和TNF-α的表达，而炎症因子表达增加通过正反馈再次激活NF-κB，进一步加重肠道紧密连接的损伤[20]。随后本研究继续利用Western blot技术检测IL-1β的表达，试验结果显示与对照组相比冷暴露组小鼠结肠中IL-1β的表达量显著上调。同时有研究表明，IL-1β可导致肠上皮紧密连接通透性增加；IL-1β引起Caco-2跨膜电阻的时间依赖性下降[21]。而IL-1β可以诱导iNOS mRNA和NO的产生[22]。本研究又检测了iNOS的表达，与对照组相比冷暴露组小鼠结肠中iNOS显著上调。研究表明iNOS表达量增加可以促进NO的产生，NO通过影响紧密连接蛋白表达的细胞信号进而损伤肠上皮细胞间的紧密连接，增加肠壁通透性[23-24]。肠道受损时，就会激发上皮细胞和巨噬细胞等分泌大量炎症因子，这些细胞因子作用于细胞之间的紧密连接结构上，破坏紧密连接蛋白，进而破坏肠道机械屏障，促进炎症反应的发生[25]。试验结果表明了肠道紧密连接与肠道炎症存在着密切关系，结肠是肠道中菌群最密集丰富的肠段，且慢性冷暴露后结肠的紧密连接受损，可能导致致病菌更容易侵入机体。

综上所述，本试验探究了慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接的影响，证明了慢性冷暴露会引发紧密连接受损，促进炎症反应的发生。而关于慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接的影响的机制、紧密连接受损和炎症反应发生的顺序以及通过保证肠道紧密连接的完整性预防肠道疾病的方法仍需要进一步深入研究。