非洲猪瘟病毒 p54 蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

郑南南，东梦珂，吴宏举，侯浩宇，陈寅龙，李 潮，赵慧君，张改平，杜永坤

(河南农业大学 动物医学院 国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州 450046)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性、出血性传染病[1]，传染源为带毒的家猪、野猪、疣猪、软蜱等[2]，主要通过呼吸道和消化道等途径传播。ASFV感染家猪后会侵害猪的各个系统：呼吸系统(肺脏、咽、喉)；泌尿系统(肾脏、膀胱)；内分泌系统(睾丸、卵巢)；消化系统(胃、小肠、大肠)等[3]。家猪感染后致死率达100%，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。非洲猪瘟首次在1920年通过撒哈拉传播到欧洲，2018年8月3日，首次在我国辽宁省沈阳市出现非洲猪瘟疫情。截止2020年，非洲猪瘟疫情已经覆盖全国31个省、自治区、直辖市和香港特别行政区[4-5]。由于ASFV的结构复杂、抵抗力强、传播速度快，至今还没有研制出特效的生物制品用于疫情防控[6]，现阶段防控措施主要依赖于隔离、扑杀、消毒、限制流通等生物防控手段来阻止疫情的蔓延。因此，迫切需要完全拥有自主知识产权的国产化诊断试剂助力我国非洲猪瘟疫情防控。

ASFV是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种双链的核质大型DNA病毒[7]，根据不同的病毒株型，有17～19万个碱基数，在基因组DNA中，并含有151～167个开放阅读框，编码150～200种蛋白，这些蛋白质不仅具有逃逸宿主防御机制，还参病毒的组装[7]。而p54蛋白就是其中的一种，由E183L基因编码，有研究表明，它能作为病毒粒子的运输工具，p54蛋白在ASFV形态发生和病毒感染过程中起着重要作用，p54蛋白还能作为诊断非洲猪瘟的一种有利工具，有报道显示家猪感染7～10 d就可以检测到p54蛋白的特异性抗体[9-10]，且p54的血清能够抑制ASFV对易感细胞的附着[11]。该研究利用大肠杆菌表达系统表达并纯化重组截短的p54蛋白，通过免疫BALB/c小鼠，制备p54蛋白的特异性单克隆抗体，为后续深入研究p54的生物学功能和ASFV相关检测试剂的研发提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 载体、细胞和实验动物pET-28a(+)载体、SP2/0 细胞均由本实验室保存，感受态细胞E.coliBL21(DE3)购自北京全式金生物科技有限公司、含有E183L基因的质粒pMD-18T-E183L由江苏东玄基因科技有限公司合成，SPF 级 BALB/c 小鼠购自郑州大学实验动物中心。

1.2 主要试剂限制性内切酶NdeⅠ、Hind Ⅲ和T4DNA连接酶购自NEB公司；卡纳霉素购自Sigma；Ni-NTA Agarose购自QIAGEN；DMEM细胞培养基、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和IPTG购自Sigma；HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG购自Protech公司；SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化学发光试剂盒购自北京博奥龙免疫技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Elisa Kit购自Proteintech公司。

1.3 p54基因的扩增本研究根据GenBank(MK128995.1)非洲猪瘟已发布的中国流行毒株中E183L的基因序列构建了pMD-18T-E183L质粒，委托江苏东玄基因科技有限公司合成。pMD-18T-E183L质粒，经DNAStar软件预测，p54蛋白N端前53氨基酸为疏水区，为利于蛋白表达将该段截去，保留剩余片段。设计PCR扩增引物，上游引物E183L-For：CGCCATATGGCGATGTCAAGTAG-GAAGAAGAAAGCTG(下划线部分为NdeⅠ酶切位点)，下游引物E183L-Rev：CCCTTGCTTGGGTTACAGGCTGTTCTCCAGGTCCTTG(下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)送至生工生物工程(上海)有限公司合成。以合成的pMD-18T-E183L为模板，利用PCR扩增技术，扩增目的基因。PCR反应条件为 1.0 μL模板，上、下游引物各0.5 μL，5.0 μL 5×Q5 Reaction Buffer，5.0 μL 5×Q5 High GC Enhancer，2.5 μL 10 mmol/L dNTPs，0.25 μL Q5酶，DEPC水补足至 25.0 μL。PCR反应条件程序为：95℃预变性5 min； 95℃变性30 s，55℃退火30 s；72℃延伸1 min 30 s， 30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收目的片段。

1.4 重组表达载体构建与鉴定用限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ同时酶切目的片段和pET-28a(+)载体，然后进行连接，连接体系：T4DNA Ligase Buffer 1.0 μL、T4DNA Ligase 0.5 μL、目的DNA片段50 ng和载体片段15 ng；16℃ 连接8 h后，转化入E.coliTrans5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素平板上，37℃培养12～16 h，挑取单个白色菌落接种于含卡那霉素的液体培养基中，37℃条件下220 r/min振荡培养，经菌液PCR鉴定正确后，提取重组质粒于37℃条件下双酶切2 h，酶切产物进行核酸凝胶电泳检测。鉴定为阳性的重组质粒命名为pET-28a(+)-p54，送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.5 p54重组蛋白的表达与纯化将测序正确的质粒pET-28a(+)-p54转化到至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，过夜培养，挑取生长状态好的菌株到含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡培养过夜。随后扩大培养，1～2 h后，D600达到0.6～0.9时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.000 1 mol/L，诱导6 h。收集菌体，经PBS重悬，超声破碎后离心，收集上清和沉淀，取样用作SDS-PAGE分析，检测蛋白的表达情况。样品经 Ni 亲和层析预装柱纯化，收集洗脱产物。进行 SDS-PAGE 分析和Western blot 鉴定分析，纯化后的蛋白使用 BCA 法测定蛋白浓度。

1.6 小鼠免疫及单克隆抗体的筛选将纯化的p54重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀，经乳化器乳化，每只小鼠皮下免疫剂量为100 μg/200 μL，首次免疫后间隔2周进行二免，共免疫3次，首次免疫用弗氏完全佐剂，后2次免疫用弗氏不完全佐剂。第3次免疫1周后采血，用间接ELISA检测血清抗体效价，选取效价最高的小鼠超免，超免3 d后进行细胞融合。取超免3 d后的小鼠脾脏制备单细胞悬液，与SP2/0细胞以10∶1的比例通过PEG1500作用进行细胞融合。通过间接ELISA方法对融合后细胞进行筛选，挑取阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法进行3次细胞亚克隆，挑取p54蛋白特异性单克隆细胞株，将其扩大培养并冻存。

1.7 单克隆抗体腹水的制备和抗体检测选择10～12周龄的BALB/c雌性小鼠，每只腹腔注射500 μL的弗氏不完全佐剂，7 d后每只腹腔注射1×106个单克隆杂交瘤小鼠腹腔明显鼓起，用注射器抽取腹水，12 000×g离心10 min，冻存备用。用间接ELISA方法测定p54蛋白抗体效价。首先用纯化的p54蛋白(终质量浓度为5 mg/L)包被96孔酶标板，每孔100 μL，于4℃ 孵育12 h，洗涤3次，用5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h，洗涤3次，将抗体以1∶100,1∶1 000,1∶10 000,1∶100 000,1∶500 000,1∶1 000 000比例稀释，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗涤3次，加入HRP-conjugated Goat anti-mouse IgG，稀释比例为1∶2 000，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗涤3次，加入TMB避光显色15 min，用3 mol/L H2SO4终止反应，测酶标仪D450 nm值。待检样品(S)/阴性对照(N)≥2.1判为阳性，S/N<2.1判为阴性，阳性孔的最大稀释度即抗体的ELISA效价。

1.8 单克隆抗体特性检测取p54蛋白加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴煮样10 min后进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后湿转至PVDF膜。将PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，洗涤3次，每次10 min；以p54鼠多抗血清或单抗以1∶2 000 比例稀释作为一抗37℃孵育1 h，洗涤3次；HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG作为二抗以1∶5 000比例稀释后37℃ 孵育1 h，洗涤3次后进行ECL发光显色。

1.9 Western blot检测使用pcDNA3.1-p54-His和pcDNA3.1-vector分别转染HEK 293T细胞，48 h 后收获细胞，加入含PMSF的RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000×g离心10 min，收取上清，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，用原核表达的p54重组蛋白做对照，100℃水浴煮样10 min 后进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后湿转至PVDF膜。将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBS’T溶液室温封闭2 h，TBS’T洗3次，每次10 min；以p54兔多抗血清或His单抗以1∶2 000比例稀释作为一抗孵育1 h，TBS’T洗3次，每次10 min；HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG或HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG作为二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBS’T洗3次，每次10 min；进行ECL发光显色。

1.10 单抗亚型检测利用商品化试剂盒Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Elisa Kit(PK20002)对单克隆抗体进行亚型鉴定。

2 结果

2.1 pET-28a(+)-p54重组表达质粒的构建经DNAStar软件预测，截去p54蛋白N端前53氨基酸疏水区序列，剩余基因片段大小为399 bp。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出片段大小与预期结果相符，为400 bp。将其与pET28a载体连接构建pET28a(+)-p54重组表达载体，经NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切后电泳结果显示出现约400 bp的目的条带(图1)，与预期相符，测序结果进一步证实插入片段与p54基因序列一致，说明重组质粒构建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.双酶切产物；2.质粒对照

2.2 重组p54蛋白的诱导表达与纯化在37℃、220 r/min条件下诱导6 h的菌液进行离心、破碎后进行SDS-PAGE分析。结果显示，与未诱导对照组相比,诱导组中出现明显的大小为 19 kDa 左右目的条带，与预期相符。未诱导的重组质粒pET-28a(+)-p54菌样品未出现对应条带，并且p54蛋白主要在上清中表达(图2)。将上清经Ni柱纯化后的样品进行SDS-PAGE和Western blot鉴定，结果如图3A显示，重组p54蛋白条带单一，纯度约为95%，即重组p54蛋白得到了较好的纯化。利用 His单抗可以在19 kDa处检测出单一特异性条带(图3B)，说明重组蛋白得到了正确表达和纯化。

M.蛋白Marker；1.未诱导；2.沉淀；3.上清

M.蛋白Marker；1.纯化的重组p54蛋白

2.3 p54蛋白单克隆抗体的筛选3次免疫2周后经ELISA测定小鼠血清p54蛋白抗体效价达到1∶500 000，超免之后3 d取小鼠脾脏制备单细胞悬液与SP2/0进行细胞融合，待融合细胞生长9～12 d形成细胞克隆团时，用间接 ELISA方法进行检测筛选。阳性孔采取有限稀释的方法，进行亚克隆，经过3次亚克隆后筛选得到2株能够稳定分泌p54蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4G6A1和8E3A6。

2.4 p54蛋白单克隆抗体腹水效价的测定将4G6A1和8E3A6 2株杂交瘤细胞扩大培养后注射小鼠腹腔制备腹水。获取腹水后将其进行梯度稀释，通过ELISA方法测定效价。结果如表1所示，8E3A6腹水效价达到1∶1 000 000，4G6A1腹水效价为1∶100 000。

表1 单克隆抗体小鼠腹水效价测定结果

2.5 p54蛋白单克隆抗体特异性检测用重组p54蛋白进行Western blot试验，用ASFV的重组p30蛋白作对照，鉴定上述2株单克隆抗体的特异性。结果如图4所示，4G6A1(图4A)和8E3A6(图4B)与重组p54蛋白反应出现单一特异性条带，而与p30重组蛋白不发生反应，说明这2株单克隆抗体能够特异性识别p54蛋白。

M.蛋白Marker；1.纯化的重组p54蛋白；2.纯化的重组p30蛋白对照

2.6 p54蛋白单克隆抗体亚型的鉴定通过商品化试剂盒对筛选得到的2株单克隆抗体进行亚型鉴定，结果如图5所示，4G6A1和8E3A6 2株单克隆抗体的重链亚型均为IgG2b，轻链亚型均为κ。

图5 p54蛋白单克隆抗体亚型鉴定

3 讨论

自2018年8月在我国首次出现非洲猪瘟[12]疫情以来，该病迅速蔓延至全国，造成大量的生猪死亡，使我国养猪业遭受空前巨大的经济损失。由于ASFV结构复杂，致病机制和免疫应答机理复杂，对研究ASFV的疫苗造成重重阻碍。p54蛋白由E318L基因编码的产物，在p54蛋白N端附近存在1个跨膜区域。有研究表明，在ASFV复制过程中p54蛋白也出现在被感染细胞的复制工厂中。p54蛋白的特异性抗体能够抑制病毒感染周期中与病毒附着有关的第一步。p54在Vero细胞中表达试验证明，p54蛋白能够在ASFV感染早期阶段激活Caspase-3从而诱导凋亡的产生，这也是首次被报道ASFV蛋白能诱导细胞凋亡。筛选ASFV主要靶蛋白并制备相应特异性单克隆抗体有助于为建立针对非洲猪瘟的血清学检测方法提供更多原材料的选择[13]。

该研究通过构建pET28a(+)-p54重组表达载体，并对p54蛋白原核表达和纯化体系的探索，建立了含有 His 标签的重组p54蛋白原核表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot检测分析，发现p54重组蛋白在上清中获得了可溶性表达，经Ni柱纯化后具有约95%的较高纯度。用纯化后的p54重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过经典的PEG融合方法制备杂交瘤细胞，用ELISA方法筛选获得2株p54蛋白特异性单克隆抗体并制备腹水，测定腹水抗体效价在100 000～1 000 000之间。Western blot 鉴定表明2株单克隆抗体均能够特异性识别p54重组蛋白。本试验获得了可溶性表达的重组p54蛋白，并且制备的p54单克隆抗体具有较好的特异性。这为进一步建立ASFV血清学检测方法、鉴定与p54相互作用蛋白和深入研究p54蛋白的生物学功能奠定了基础。