lncRNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p轴影响脑胶质瘤细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的分子机制研究

2023-01-28刘湛魏启明李莹济南市中西医结合医院脑病科济南271199

中国免疫学杂志 2022年21期

刘湛魏启明李莹（济南市中西医结合医院脑病科，济南 271199）

人脑胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤，致死率较高，严重威胁患者生命安全。目前，随着治疗手段的不断进步，胶质瘤患者预后有了较大改善，但整体治疗效果仍不令人满意［1］。胶质瘤的发病机制尚未明确，探究其发生发展的分子机制可为阐明其发病机制提供新途径，并为其治疗提供分子靶点。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与微小RNA（miRNA）是真核生物中存在的两类小分子非编码RNA，且lncRNA可发挥miRNA分子海绵作用，调控miRNA靶基因表达，进而发挥生物学调控功能，影响人类肿瘤的发生发展［2-3］。DNAJC3的反义RNA1（DNAJC3-AS1）属于lncRNA家族成员，参与多种肿瘤发展进程。有报道称，lncRNA DNAJC3-AS1在肾细胞癌组织及细胞系中表达明显上调，沉默其表达可有效阻碍肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制与发挥miR-27a-3p分子海绵作用，调控PRDM14表达有关，对肾细胞癌的发生发展发挥重要作用［4］；lncRNA DNAJC3-AS1在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）组织中表达升高，且与CRC患者预后不良密切相关，干扰其表达可降低CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，可能成为CRC诊断和治疗的新靶点［5］。但目前lncRNA DNAJC3-AS1是否影响脑胶质瘤的发生发展尚未明确。

Starbase靶基因在线预测软件显示，lncRNA DNAJC3-AS1可能靶向结合miR-3619-5p。研究显示，miR-3619-5p在骨肉瘤、皮肤鳞状细胞癌、胃癌和胆囊癌等肿瘤中表达降低，是肿瘤发生发展的抑制基因［6-9］。但目前miR-3619-5p对脑胶质瘤发生发展的影响尚不明确。本研究首先检测脑胶质瘤组织及细胞系中lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的表达，并观察lncRNA DNAJC3-AS1与miR-3619-5p对脑胶质瘤细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响及lncRNA DNAJC3-AS1能否靶向miR-3619-5p发挥作用，以期为胶质瘤的治疗提供新的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料收集34例2017年5月至2019年5月于济南市中西医结合医院脑病科确诊并行手术治疗的胶质瘤患者肿瘤组织，液氮保存，其中男性19例，女性15例，平均年龄（56.31±6.82）岁。纳入标准：符合世界卫生组织胶质瘤组织病理学诊断标准；首次确诊；术前未进行放化疗等治疗。排除标准：肝脏、肾脏等功能无障碍；合并其他恶性肿瘤。另收34例同时期行脑外伤内减压术患者的正常脑组织为对照组，其中男性22例，女性12例，平均年龄（50.26±7.95）岁。本研究经济南市中西医结合医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.1.2 细胞和主要试剂正常神经胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系LN18、SW1088和Hs683购自上海弘顺生物科技有限公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自大连宝生物；si-lncRNA DNAJC3-AS1、si-NC、miR-3619-5p mimics、miR-NC、anti-miR-3619-5p及anti-miR-NC购自上海吉玛制药技术；RPMI1640培养液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒、双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝；胎牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；兔抗人上皮型钙黏蛋白（E-cad⁃herin）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗购自北京中杉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表达在液氮保护下研磨脑胶质瘤组织及正常脑组织，用RNA抽提试剂提取细胞中总RNA，逆转录后扩增。扩增程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35个循环。lncRNA DNAJC3-AS1正向引物：5'-AGCGATTGTGGAAGACCCTG-3'，反向引物：5'-ATTTCCCCTGGTAAGCG⁃CAA-3'；miR-3619-5p正向引物：5'-TCATCAGCAG⁃GCAGGCTGGTGC-3'，反向引物：5'-GTGCAGGGTCCCGAGGT-3'；GAPDH正向引物：5'-CAACAGCCT⁃CAAGATCATCAGC-3'，反向引物：5'-TTCTAGACG⁃GCAGGTCAGGTC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTC⁃GGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法计算lncRNA DNAJC3-AS1相对于GAPDH、miR-3619-5p相对于U6的表达量。

1.2.2 细胞培养在超净工作台内复苏正常神经胶质细胞HEB及胶质瘤细胞系LN18、SW1088和Hs683，均用含10%FBS的RPMI1640培养液培养。取对数期的各细胞接种至6孔板（1.0×105个/孔），培养24 h后，收集细胞，RT-qPCR检测各细胞中lnc-RNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表达，方法同

1.2.1 ，选择较HEB细胞表达差异最显著的LN18细胞进行后续实验。

1.2.3 LN18细胞转染将对数期LN18细胞接种至6孔板（1.0×105个/孔），培养24 h后，采用Lipo⁃fectamineTM2000脂质体法分别转染si-lncRNA DNAJC3-AS1（si-lncRNA DNAJC3-AS1组）、si-NC（si-NC组）、miR-3619-5p mimics（miR-3619-5p组）、miRNC（miR-NC组）、共转染si-lncRNA DNAJC3-AS1与anti-miR-3619-5p（si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p组）、si-lncRNA DNAJC3-AS1与anti-miR-NC（si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC组）。转染12 h后，更换新鲜培养液，再培养24 h，RT-qPCR检测细胞中lncRNA DNAJC3-AS1或miR-3619-5p表达验证转染效果，方法同1.2.1，并收集细胞用于后续实验。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭迁移实验：将Transwell小室置于24孔板中，在上室加入100μl含5.0×104个细胞的各转染后的LN18细胞悬液，下室加入500μl含10%FBS的RPMI1640培养液。培养24 h后，弃培养液，取出小室，用棉签擦去上层未穿过基底膜的细胞。然后用4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min后，PBS清洗3次，置于显微镜下观察。随机取5个视野，统计迁移细胞数。侵袭实验：将Matrigel基质胶在4℃冰箱中融化，于冰上用不含FBS的RPMI1640培养液以1∶8比例稀释，铺于Transwell小室上室，并自然晾干。然后加入各组转染后的LN18细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.2.5 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达将转染后的各组细胞接种至6孔板（1.0×105个/孔），培养24 h后，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。BCA试剂盒检测蛋白浓度后，行10%SDS-PAGE电泳，恒压80 V，进入分离胶后转为恒压120 V。电泳结束后，将分离蛋白转移至PVDF膜，转膜电流200 mA，时间90 min。然后以5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h，分别用E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin（1∶1 000）一抗在4℃冰箱中孵育过夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）于37℃下孵育1 h。再次洗膜后，滴加化学发光试剂，避光显影后，采用凝胶系统曝光拍照，Image J软件分析E-cadherin、N-cadherin和Vimentin相对于β-actin的表达量。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验PCR扩增含miR-3619-5p结合位点的lncRNA DNAJC3-AS1核苷酸序列，构建lncRNA DNAJC3-AS1野生型（lnc-RNA DNAJC3-AS1-WT）荧光素酶载体；同时将结合位点突变后构建lncRNA DNAJC3-AS1突变型（lnc-RNA DNAJC3-AS1-MUT）荧光素酶载体，该过程由上海吉玛制药技术有限公司完成。将对数期LN18细胞接种至6孔板（1.0×105个/孔），LipofectamineTM2000脂质体法分别共转染miR-3619-5p mimics与WT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-NC与WT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-3619-5p mimics与MUT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-NC与MUT-lncRNA DNAJC3-AS1。转染12 h后，更换新鲜培养液再培养24 h，收集细胞，加入细胞裂解液裂解，3 500 r/min离心5 cm，取上清，检测荧光素酶活性，其结果以萤火虫与海肾的荧光强度比值表示。

1.3 统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。两组间比较用独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在脑胶质瘤组织中的表达脑胶质瘤组织中lncRNA DNAJC3-AS1表达明显高于正常脑组织（3.45±0.37vs1.00±0.12，t=18.896，P<0.05），而miR-3619-5p表达明显低于正常脑组织（0.48±0.07vs1.00±0.14，t=9.966，P<0.05）。

2.2 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在胶质瘤细胞系中的表达与正常神经胶质细胞HEB相比，胶质瘤细胞系中lncRNA DNAJC3-AS1表达升高（P<0.05），miR-3619-5p表达降低（P<0.05），选择lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表达较HEB细胞差异最为显著的胶质瘤细胞LN18进行后续研究。见表1。

表1 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在胶质瘤细胞系中的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of lncRNA DNAJC3-AS1 and miR-3619-5p in glioma cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with HEB cells，1）P<0.05.

Groups HEB LN18 SW1088 Hs683 F P lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.09 2.76±0.181）2.27±0.151）1.87±0.121）258.124 0.000 miR-3619-5p 1.00±0.08 0.34±0.031）0.47±0.051）0.53±0.041）261.579 0.000

2.3 下调lncRNA DNAJC3-AS1抑制胶质瘤LN18细胞迁移、侵袭和EMT与NC组或si-NC组相比，si-lncRNA DNAJC3-AS1组LN18细胞中lncRNA DNAJC3-AS1表达降低（P<0.05），细胞迁移数、侵袭数及细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低（P<0.05），E-cadherin蛋白表达升高（P<0.05），而NC组或si-NC组各检测指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1、表2。

表2 下调lncRNA DNAJC3-AS1抑制LN18细胞迁移、侵袭和EMT（±s，n=9）Tab.2 Down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group or si-NC group，1）P<0.05.

Groups NC si-NC si-lncRNA DNAJC3-AS1 t P lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.08 1.04±0.09 0.45±0.031）190.578 0.000 E-cadherin 0.40±0.04 0.38±0.03 0.87±0.071）280.581 0.000 N-cadherin 0.75±0.07 0.73±0.06 0.32±0.031）169.181 0.000 Vimentin 0.92±0.07 0.94±0.08 0.49±0.031）143.041 0.000 Migration 216±13.05 219±10.09 102±7.191）370.971 0.000 Invasion 169±11.09 164±8.96 78±3.611）326.669 0.000

图1 下调lncRNA DNAJC3-AS1对LN18细胞迁移、侵袭及细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响Fig.1 Effects of down-regulated lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

2.4上调miR-3619-5p抑制胶质瘤LN18细胞迁移、侵袭和EMT与miR-NC组相比，miR-3619-5p组LN18细胞中miR-3619-5p表达升高（P<0.05），细胞迁移数、侵袭数及细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低（P<0.05），E-cadherin蛋白表达升高（P<0.05）。见表3、图2。

表3 上调miR-3619-5p抑制LN18细胞迁移、侵袭和EMT（±s，n=9）Tab.3 Up-regulation of miR-3619-5p inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-3619-5p t P miR-3619-5p 1.00±0.06 2.19±0.141）25.697 0.000 E-cadherin 0.37±0.02 0.91±0.091）11.661 0.000 N-cadherin 0.75±0.07 0.35±0.031）15.757 0.000 Vimentin 0.94±0.08 0.43±0.041）17.106 0.000 Migration 247±15.16 91±6.131）28.620 0.000 Invasion 161±10.97 82±5.191）19.529 0.000

图2 上调miR-3619-5p对LN18细胞迁移、侵袭及细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响Fig.2 Effects of up-regulated miR-3619-5p on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

2.5 lncRNA DNAJC3-AS1靶向负调控miR-3619-5p

Starbase靶基因在线预测软件显示，lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的核苷酸序列存在连续结合位点（图3）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-3619-5p与WT-lncRNA DNAJC3-AS1共转染后LN18细胞荧光素酶活性明显降低（P<0.05），而与MUT-lncRNA DNAJC3-AS1共转染后LN18细胞荧光素酶活性无明显变化（P>0.05），提示lncRNA DNAJC3-AS1可靶向结合miR-3619-5p，见表4。同时si-lncRNA DNAJC3-AS1组lncRNA DNAJC3-AS1表达低于si-NC组（0.48±0.02vs1.00±0.01，t=69.765，P<0.05），miR-3619-5p表达量高于si-NC组（1.91±0.11vs1.00±0.11，t=17.549，P<0.05），进一步说明lncRNA DNAJC3-AS1负调控miR-3619-5p。

图3 Starbase靶基因在线软件预测lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的结合位点Fig.3 Binding sites of lncRNA DNAJC3-AS1 and miR-3619-5p predicted by Starbase target gene online software

表4 双荧光素酶活性检测结果（±s，n=9）Tab.4 Test results of dual luciferase activity（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-3619-5p t P WT-lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.08 0.43±0.031）20.014 0.000 MUT-lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.09 0.97±0.08 0.747 0.466

2.6下调miR-3619-5p可逆转下调lncRNA DNAJC3-AS1对胶质瘤LN18细胞迁移、侵袭和EMT的影响与si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC组相比，silncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p组LN18细胞中miR-3619-5p表达降低（P<0.05），细胞迁移数、侵袭数及细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高（P<0.05），E-cadherin蛋白表达降低（P<0.05）。见表5、图4。

表5 下调miR-3619-5p可逆转下调lncRNA DNAJC3-AS1对LN18细胞迁移、侵袭和EMT的影响（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-3619-5p can reverse effect of down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p t P miR-3619-5p 1.00±0.09 0.42±0.031）18.341 0.000 E-cadherin 0.89±0.06 0.43±0.031）20.572 0.000 N-cadherin 0.34±0.02 0.77±0.061）20.397 0.000 Vimentin 0.47±0.03 0.81±0.071）13.393 0.000 Migration 105±8.06 227±18.121）18.455 0.000 Invasion 75±6.19 169±1.241）44.670 0.000

图4 同时下调miR-3619-5p与lncRNA DNAJC3-AS1对LN18细胞迁移、侵袭及细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响Fig.4 Effects of both down-regulated miR-3619-5p and lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

3 讨论

胶质瘤的发生发展与原癌基因的异常激活及抑癌基因的失活密切相关，研究胶质瘤中异常表达的基因分子及其作用机制可为胶质瘤发病机制的阐明及治疗靶点的选择提供新途径。lncRNA是长度超过200个核苷酸的小分子非编码RNA，可靶向结合miRNA，调控miRNA靶基因表达，进而影响肿瘤发展进程。研究显示，多种lncRNAs在胶质瘤中异常表达，参与胶质瘤发生发展。例如，神经胶质瘤细胞系中lncRNA HNF1A-AS1呈高表达，敲减其表达可靶向miR-32-5p/SOX4轴对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用，为神经胶质瘤的治疗提供了潜在的新型治疗靶点［10］；lncRNA CTBP1-AS2在胶质瘤组织中表达增加，其可通过竞争性结合miR-370-3p并上调Wnt7a表达促进胶质瘤细胞的增殖、迁移及EMT过程，进而促进胶质瘤的发展进程［11］；lncRNA TPTEP1在胶质瘤中表达降低，在体外和体内均可减轻神经胶质瘤的干性和抗辐射性，其作用机制与靶向调控miR-106a-5p/MAPK14轴有关，可作为神经胶质瘤治疗的分子靶标［12］。

lncRNA DNAJC3-AS1是近年来新发现的一种lncRNA，参与调控多种肿瘤的发展进程。研究显示，下调lncRNA DNAJC3-AS1可通过靶向负调控miR-214-3p进而抑制LIVIN表达以阻碍结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭和EMT过程，lncRNA DNAJC3-AS1可能为结肠癌的治疗提供了新的分子靶点［13］；骨肉瘤中lncRNA DNAJC3-AS1表达升高，其可促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并降低骨肉瘤对顺铂的敏感性，可能是骨肉瘤的治疗靶标［14］。本研究显示，脑胶质瘤组织和细胞系中lncRNA DNAJC3-AS1表达明显升高，提示其可能促进胶质瘤发展进程；通过下调lncRNA DNAJC3-AS1表达降低了胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力，提示lncRNA DNAJC3-AS1可能成为脑胶质瘤治疗的分子靶点。

EMT是细胞失去上皮极性而获得间质细胞特性的过程，在这一过程中，上皮标志物如E-cadherin表达降低，而间质标志物如N-cadherin和Vimentin表达升高［15］。肿瘤细胞在经历EMT过程后，细胞骨架发生改变，细胞间黏附作用降低，迁移和侵袭能力增强［16］。因此，抑制肿瘤细胞EMT过程对降低肿瘤转移具有重要意义。本研究显示，下调lncRNA DNAJC3-AS1可促进脑胶质瘤细胞中E-cadherin蛋白表达，抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表达，说明下调lncRNA DNAJC3-AS1可阻碍脑胶质瘤细胞EMT过程，进而降低脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。

为进一步探究下调lncRNA DNAJC3-AS1抑制脑胶质瘤细胞迁移、侵袭及EMT过程的分子机制，本研究证实了lncRNA DNAJC3-AS1可靶向负调控miR-3619-5p，这与本文脑胶质瘤组织和细胞系中lncRNA DNAJC3-AS1表达升高而miR-3619-5p表达降低的分子机制一致。研究显示，lncRNA HEIH在卵巢癌组织和细胞系中表达上调，而miR-3619-5p表达下调，lncRNA HEIH可通过靶向miR-3619-5p/CTTNBP2轴促进体外卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭及体内肿瘤生长，对寻找改善卵巢癌治疗的新靶点具有重要意义［17］；lncRNA PVT1在抗顺铂的胃癌组织和细胞中表达上调，沉默其表达可通过靶向miR-3619-5p下调TBL1XR1进而增强抗顺铂的胃癌细胞对顺铂的敏感性，并抑制细胞生长，为逆转胃癌顺铂耐药性提供了潜在分子靶点［18］。本研究通过上调脑胶质瘤细胞中miR-3619-5p的表达发现，上调miR-3619-5p可阻碍脑胶质瘤细胞迁移、侵袭及EMT过程，提示miR-3619-5p可作为抑制胶质瘤侵袭转移的分子靶点。本研究结果还显示，下调miR-3619-5p可逆转下调lncRNA DNAJC3-AS1对LN18细胞迁移、侵袭及EMT的抑制作用，提示lncRNA DNAJC3-AS1可能通过靶向负调控miR-3619-5p影响脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

综上所述，lncRNA DNAJC3-AS1在胶质瘤组织及细胞系中表达升高，其可能通过靶向下调miR-3619-5p来促进脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭，lnc-RNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p轴可能为胶质瘤的治疗提供了新的分子靶点。但本研究尚存在不足之处，尚未探究miR-3619-5p下游靶基因及信号通路，且仅在体外细胞层面进行了探究，还需通过裸鼠移植瘤实验进一步在体内验证lncRNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p轴对胶质瘤侵袭和转移的影响。