溶剂诱导萃取/UPLC-MS/MS法高通量检测环境水体中12种除草剂

陈 静，王 波，王新潮，王 娟，王玉新，谌 越，瞿德业*

（1．西北师范大学 地理与环境科学学院，甘肃 兰州 730070；2．甘肃省绿洲资源环境与可持续发展重点实验室，甘肃 兰州 730070；3．兰州海关技术中心，甘肃 兰州 730070）

除草剂是指能杀死杂草或有害植物，而不影响农作物正常生长的化学药剂，可用于防治农田杂草或杀灭非农耕地的杂草或灌木［1］。除草剂被广泛应用于稻谷、水果、蔬菜等种植业中，造成了稻谷、水果、蔬菜、水体及土壤中除草剂及其代谢物的残留［2］。残留的除草剂通过生物积累和扩散到食物链中，对人体健康构成威胁。因此，除草剂残留造成的伤害不容忽视。目前，除草剂残留的检测方法主要包括气相色谱法（GC）［3］、液相色谱法（LC）［4-5］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS∕MS）［6］、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS∕MS）［7］等。其中，气相色谱法在果蔬农药残留检测中应用较广，检测范围较宽，但不适用于检测难挥发和热不稳定的化合物［8］；液相色谱法、气相色谱-串联质谱法在除草剂高通量检测中的应用较少；高效液相色谱-串联质谱法的灵敏度高、抗干扰能力强。

在农药残留分析中，样品前处理所需时间通常占分析时间的61%，并对分析的可靠性和准确性起至关重要的作用，因此前处理是分析检测的重要环节［9］。除草剂残留的常规前处理方法有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、凝胶渗透色谱等技术［10-11］，以上前处理方法操作时间长［12］，且操作过程复杂，制约因素多，对实验人员的动手能力要求高。溶剂诱导萃取技术的最大优势为经萃取剂诱导分离的乙腈层和水层能够将疏水性和亲水性物质在线分离，从而实现样品的净化和浓缩，且有机相与反相UPLC流动相兼容，可直接进样分析［13］。本研究基于乙腈与水互溶，在匀相的乙腈-水体系中添加一种疏水且与乙腈互溶的有机溶剂，从而诱导乙腈-水体系分层的原理，建立了一种溶剂诱导萃取∕超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS∕MS）同时检测环境水体中12种除草剂的方法。该方法灵敏度高，抗干扰能力强，前处理耗时短，为环境水体中除草剂的高通量检测提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Agilent公司）；多管涡旋混合仪（美国Scientific Industries）；台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；移液枪（美国Thermo Electron公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸铵、二氯甲烷、三氯甲烷、氯化钠、甲酸（纯度 ＞98%）；实验用水为蒸馏水（屈臣氏），12种除草剂混合标准溶液（10 mg∕L，阿尔塔科技有限公司）。

12种除草剂标准储备溶液：准确移取上述标准溶液各1．0 mL，用乙腈-水（体积比1∶1）定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1．0 mg∕L的12种除草剂混合标准储备溶液，冷藏待用。

1.2 样品前处理

准确量取10 mL水样，加入等体积乙腈，涡旋5 min后，加入1．0 mL二氯甲烷，涡旋5 min后静置3 min。在6 ℃下以10 000 r∕min离心7 min，乙腈-水溶液分层，上层为乙腈层，下层为水层，记录上下层体积。分别取1．0 mL过0．22 µm有机滤膜，滤液装入棕色进样瓶，待测。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm × 2．1 mm，1．8 µm，美国Agilent公司）；流动相A：0．1%甲酸水；B：乙腈（0．1%甲酸水）；进样量：2 µL；柱温：30 ℃；流速：0．30 mL∕min。流动相洗脱梯度：0 ～ 1 min，30% B；1 ～ 2 min，30% ～ 50% B；2 ～ 9 min，50% B；9 ～9．5 min，50% ～ 30% B；9．5 ～ 10 min，30% B。

1.3.2 质谱条件采用多反应监测（MRM）正离子方式扫描，电喷雾离子源（ESI），毛细管电压为3 500 V；雾化气压力为275．8 kPa；干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10 L∕min。经优化后，12种除草剂的定性定量离子对、保留时间、碰撞能量及碎裂电压见表1。

表1 12种除草剂的保留时间以及MRM参数Table 1 Retention times and MRM parameters of 12 herbicides

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 萃取剂的选择萃取剂是决定萃取效率的关键因素，选择合适的萃取剂需考虑萃取剂的密度、挥发性、对目标物质的萃取能力以及对后续色谱分离分析的影响［14］。与乙腈互溶的疏水性溶剂均能作为萃取剂诱导乙腈-水体系分层［13］，因此本实验对比了不含氧萃取剂（如二氯甲烷）、无机盐（如NaCl）以及不常用的三氯甲烷3种萃取剂的效果。在空白水样中添加12种除草剂混合标样，按照“1．2”处理，比较乙腈层中12种除草剂的含量，并通过计算回收率确定12种除草剂的转移率（图1）。结果表明，以二氯甲烷为萃取剂时，目标物的回收率最高，因此选择二氯甲烷作为萃取剂。

图1 不同萃取剂对目标物回收率的影响Fig．1 Effects of different extractants on the recoveries of target compounds

2.1.2 萃取剂体积的选择考察了萃取剂二氯甲烷的体积对目标化合物回收率的影响。在其他条件一致的情况下，配制10 µg∕L空白加标水样，分别添加不同体积（0．8、1．0、1．2、1．5 mL）的二氯甲烷，按照“1．2”处理后上机测定。结果表明，二氯甲烷体积为1．0 mL时，12种除草剂的回收率总体最高，因此选择二氯甲烷体积为1．0 mL。

2.1.3 提取剂体积的选择以乙腈为提取剂，考察了不同体积乙腈对目标物回收率的影响，分别取4．0、6．0、8．0、10、12、14、16 mL乙腈，按照“1．2”处理后上机测定，发现目标物主要集中在上层乙腈层，因此主要比较上层物质的回收率。发现乙腈体积为10 mL时目标物的出峰效果最好，回收率较高，因此选择乙腈体积为10 mL。

2.1.4 离心时间的选择为使二氯甲烷的萃取效果更显著，在其他条件一致的情况下，配制10 µg∕L空白加标水样，考察了离心时间（5、6、7、8、9、10 min）对12种除草剂回收率的影响，按照“1．2”处理后上机测定。结果表明，离心时间在5 ～ 7 min时目标物的回收率增加较快，离心时间在7 ～ 10 min时目标物的回收率下降，因此选择离心时间为7 min。

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面设计及结果由“2．1”结果可知，以二氯甲烷作为萃取剂时12种除草剂的萃取效果最好，且乙腈体积为8．0、10、12 mL时目标物的回收率较好。因此，通过极差对单因素水平进行筛选，最终选择提取剂乙腈体积、萃取剂二氯甲烷体积、离心时间为考察因素，通过响应面法对3个单因素进行分析，实验方案及结果见表2。

利用Design Expert10软件对表2数据进行方差分析。由表3可知，乙腈体积（P＜ 0．01）和二氯甲烷体积（P＜ 0．01）对12种除草剂回收率的影响极显著。以12种除草剂的回收率为响应值，经拟合得到回归方程：Y= 95．60 + 4．86A - 9．87B - 2．69C - 0．93AB + 1．40AC - 0．075BC - 9．08A2- 14．80B2- 9．42C2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根据方差分析结果，该模型的相关系数（r2）为0．983，说明模型的可信度高。该模型达到极显著水平（P＜ 0．01），表明该二次模型能够拟合实际结果，误差较小，可利用此回归方程确定12种除草剂的最佳萃取条件。由表3还知，A、B、A2、B2、C2对12种除草剂的回收率产生极显著影响（P＜ 0．01），而AB、AC、BC对目标物回收率的影响不显著。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面结果各因素交互作用的响应面和等高线图见图2。响应面图可较直观地显示各因素交互作用对除草剂回收率的影响，曲线越陡峭，则表明该因素的影响越大［15］。由表3及图2可见，二氯甲烷体积对除草剂回收率的影响最大，乙腈体积、二氯甲烷体积、离心时间之间的交互作用对目标物回收率的影响不大。根据软件计算结果，预测12种除草剂的最佳回收率为97．8%，乙腈体积为10．7 mL，二氯甲烷体积为1．1 mL，离心时间为6．9 min。将上述条件简化为乙腈体积10 mL、二氯甲烷体积1．0 mL、离心时间7 min，进行5次重复实验，得到12种除草剂的平均回收率为96．5%，测定结果与理论结果较一致。因此确定乙腈体积为10 mL，二氯甲烷体积为1．0 mL，离心时间为7 min。

图2 各因素交互作用的响应面和等高线图Fig．2 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.3 仪器条件的优化

2.3.1 质谱参数的选择将质量浓度为100 µg∕L的混合标准溶液采用正离子模式扫描，选择峰强度较大的离子作为定性和定量离子。根据选择的离子对优化去簇电压和碎裂电压，再对电喷雾电压、离子源温度和驻留时间等参数进行优化，得到的最佳质谱条件如“1．3．2”所示。虽然各离子的色谱图会有重叠，但各峰的定量离子和定性离子不同，因此不影响定量分析［16］。通过梯度洗脱可实现多种化合物的有效分离，且峰形较好。12种除草剂的总离子流图如图3所示。

图3 12种除草剂混合标准溶液（100 µg∕L）的总离子流图Fig．3 Total ion chromatogram of 12 herbicides mixed standard solution（100 µg∕L）

2.3.2 色谱柱的选择比较了ACQUITY UPLCTMBEH C18（1．0 mm × 50 mm，1．7 µm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 µm）两款色谱柱对12种化合物分离效果的影响。结果显示，使用后者能使12种目标物的峰形对称，色谱响应较高。该柱适用于高压条件下操作（高达60 MPa），且装填了高性能的微粒C18填料可用于高速反相HPLC，对所有类型化合物分析均能得到高柱效和优异峰形。因此选用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 µm）色谱柱。

2.3.3 流动相的优化由于待测化合物均在正离子模式下进行检测，理论上母离子大部分是H+、和Na+，因此在流动相中加入甲酸或乙酸铵可以提高待测物的离子化效率，提高质谱响应［17］。考察了水（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸铵）-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸铵）、0．1%甲酸水-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸铵）、0．1%甲酸水-乙腈、0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）4种流动相对12种除草剂分离效果的影响。结果显示，以0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）为流动相时，所有目标化合物的响应强度最高，出峰时间最短，因此选择该流动相进行分离。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

用乙腈-水（1∶1）配制0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 µg∕L的标准系列工作溶液，按照优化的实验条件进行测定，以各目标化合物的质量浓度为横坐标（x，µg∕L），对应的峰面积响应值为纵坐标（y）绘制标准曲线。结果表明，12种除草剂在各自的质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均大于0．999 5。以3倍信噪比计算得到目标化合物的检出限（LOD）为0．05 ～ 0．5 µg∕L，以10倍信噪比计算得到目标化合物的定量下限（LOQ）为0．2 ～ 5．0 µg∕L（见表4）。

表4 12种除草剂的线性关系、检出限及定量下限Table 4 Linear relations，detection limits and quantitation limits

2.5 准确度与精密度

选择空白水样准确加入适量的混合标准溶液，配制成0．5、5、50 µg∕L的加标样品，按照优化的实验条件进行处理和测定，每个加标水平重复测定5次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），以评价该方法的准确度和精密度。由表5可知，3个加标水平下12种除草剂的回收率为83．0% ～ 110%，RSD为0．30% ～ 5．0%，表明本方法的准确度和精密度较好。

表5 加标水样的平均回收率及相对标准偏差（n = 5）Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of spiked water samples（n = 5）

2.6 与标准方法的比较

与GB∕T 5750．8-2006 《生活饮用水标准检验方法 有机物指标》［18］和GB∕T 23214-2008 《饮用水中450种农药及相关化学品残留量的测定》［19］标准方法相比，本方法前处理只需乙腈、二氯甲烷2种试剂，而标准方法需使用乙腈、无水乙酸钠、无水硫酸镁、甲苯等多种试剂，成本升高；本方法只需涡旋、离心、分层、进样，操作简单，有利于进行高通量、快速的样品处理，且对操作要求较低；本方法前处理仅耗时30 min，标准方法的前处理时间为本方法的2 ～ 3倍；本方法的检出限最高为0．5 µg∕L，而标准方法的检出限最高为34．37 µg∕L。综上，本方法试剂用量少，操作简单，前处理耗时短，灵敏度高。

2.7 实际样品的测定

为验证本方法的实用性，采集湖水、河水、二次供水、饮用水、农田灌溉水各10份共50份样品，采用本方法进行测定。结果在实际样品中检出莠灭净、氰草津、氯磺隆，其中河水中检出4．2 µg∕L氰草津，湖水中检出3．6 µg∕L莠灭净，农田灌溉水中分别检出5．3 µg∕L莠灭净、6．5 µg∕L氰草津和15．8µg∕L氯磺隆。特别是农田灌溉水，氯磺隆的检出率高达30%，这可能是由于农田中除草剂的使用频率较高，一部分除草剂会渗透到土壤中，灌溉农田时再次溶入水中；氯磺隆的残留期长，所以在农田灌溉水中检出浓度较高，应多给予关注。二次供水、饮用水中均未检出12种除草剂。

3 结 论

本文通过单因素实验和响应面分析得到最优的前处理条件，建立了测定环境水样中12种除草剂的溶剂诱导萃取∕UPLC-MS∕MS法。12种除草剂的回收率为83．0% ～ 110%，RSD为0．30% ～ 5．0%，检出限为0．05 ～ 0．5 µg∕L，定量下限为0．2 ～ 5．0 µg∕L，方法学指标均能满足检测要求。溶剂诱导萃取技术不仅能够提高检测通量，而且试剂用量少，能够在线完成净化和富集，操作简单，前处理用时少，有效降低了实验成本。该方法可为除草剂或农药残留的高通量检测提供新思路。