超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查睫毛用化妆品中前列腺素F2α类化合物

王欣然，尹伟成，王海燕，路 勇*

（1．中国食品药品检定研究院∕国家药品监督管理局化妆品研究与评价重点实验室，北京 100050；2．湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001）

前列腺素（PGs）是一类由花生四烯酸衍生而来的20碳不饱和脂肪酸。其中前列腺素F2α（PGF2α）是目前最具潜力和最有效的用于治疗青光眼的药物［1］，包括比马前列素、拉坦前列素、曲伏前列素等物质，能够通过增加眼内液体的流出来降低眼压。研究发现，PGF2α类化合物除对青光眼有治疗作用外，还有引起睫毛增长的功效［2］。针对这一特点，Allergan公司研发了全球首个获得FDA批准的处方药Latisse（含有0．03%比马前列素）用于治疗睫毛稀少症。虽然PGF2α可使睫毛增长，但同时会刺激眼部，出现虹膜颜色加深、眼部不适、虹膜炎等不良反应，长时间使用可能会导致失明［3-4］。目前，我国现行的《化妆品安全技术规范》（2015版）［5］未对此类化合物作出明确规定，《已使用化妆品原料目录（2021年版）》［6］未包含该类物质，使得一些不良化妆品企业为快速增强自身“竞争力”，钻取法规漏洞，利用监管薄弱的现状，在睫毛用化妆品中添加PGF2α类化合物，对消费者的健康造成不良影响。

目前PGF2α类化合物的检测方法主要集中于药品领域，包括荧光分光光度法［7］、高效液相色谱法［8-11］、液相色谱-串联质谱法［12-13］等。化妆品中PGF2α的测定方法主要为高效液相色谱-串联三重四极杆低分辨质谱法［14］。低分辨质谱定量准确，但只能对靶向化合物进行分析；高分辨质谱定性准确，具有质量范围宽、质量精度及分辨率高、数据库检索等特点，尤其是可对无标准品的化合物进行高通量快速定性筛查，目前广泛应用于食品中农药、抗生素、激素等物质的快速筛查分析［15-18］。

针对化妆品行业的非法添加现状，本课题组采用四极杆飞行时间（Q-TOF）高分辨质谱技术建立了化妆品中激素、抗生素、抗组胺类药物、致敏性化合物、农药、麻醉类药物等风险物质的筛查平台，用于化妆品中已知或未知风险物质的识别和发现［19］。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS∕MS）对9种PGF2α类化合物（结构信息见图1）进行数据采集，获得其色谱及质谱响应值，构建了9种PGF2α类化合物的高分辨筛查数据库，采用空白基质加标对所建数据库进行修正，并用于市售化妆品的定性筛查，为监管部门对化妆品中违禁组分的高通量快速筛查提供了技术支撑。

图1 9种化合物的分子结构Fig．1 Structures of 9 compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo G2 XS四极杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC I Class超高效液相色谱仪、MassLynx V 4．2数据处理操作平台、UNIFI科学信息学系统（美国Waters公司）；BTV-100涡旋振荡器（上海一恒科技有限公司）；AL 204型电子天平（美国Sartorius公司）；G10型离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

比马前列素（纯度99．9%）、曲伏前列素（纯度99．4%）、他氟前列素（纯度97．2%）、他氟乙酰胺（纯度98．2%）、拉坦前列素（纯度99．0%）、比马前列素酸甲基酯（纯度99．9%）、氯前列醇异丙基酯（纯度99．9%）、15-酮-曲伏前列素（纯度94．6%）、比马酰胺（纯度99．9%）（以上标准品均购自天津阿尔塔科技有限公司）；乙腈、甲酸铵（质谱纯，Fisher公司）；甲酸（质谱纯，Honeywell公司）；屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制准确称取各PGF2α标准品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，摇匀，配制成质量浓度为100 µg∕mL的标准储备液。精密吸取上述各PGF2α标准储备液1 mL，用乙腈稀释定容至100 mL，配制成质量浓度为1 µg∕mL的标准中间溶液。

精密吸取标准中间溶液适量，用50%乙腈溶液稀释得到比马前列素、他氟乙酰胺、拉坦前列素、比马前列素酸甲基酯、氯前列醇异丙基酯、15-酮-曲伏前列素、比马酰胺质量浓度为5 ～ 100 ng∕mL的标准工作溶液，曲伏前列素、他氟前列素质量浓度为50 ～ 1 000 ng∕mL的标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理准确称取0．2 g样品（精确至0．001 g），置于15 mL离心管中，加入乙腈约8 mL，涡旋1 min充分混匀后，超声提取20 min，放置至室温后定容至10 mL，摇匀。以8 000 r∕min离心10 min，上清液经0．22 µm滤膜过滤（可根据实际情况进行稀释），待测。

1.2.3 液相色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2．1 mm × 100 mm，1．7 µm）；柱温：40 ℃；流动相：2 mmol∕L甲酸铵水溶液（含0．05%甲酸）（A）-乙腈（B）；流速：0．35 mL∕min；进样量：3．0 µL；梯度洗脱程序：0 ～ 0．5 min，2% B；0．5 ～ 2．0 min，2% ～ 30% B；2．0 ～ 6．0 min，30% ～ 40%B；6．0 ～ 13．0 min，40% ～ 70% B；13．0 ～ 16．0 min，70% ～ 98% B；16．0 ～ 18．0 min，98% B；18．0 ～18．5 min，98% ～ 2% B；18．5 ～ 20．0 min，2% B。

1.2.4 质谱条件电喷雾正离子模式；毛细管电压为1 kV；离子源温度为120 ℃；采样锥电压为20 V；脱溶剂温度为550 ℃；锥孔气流速为50 L∕h；脱溶剂气流速为1 000 L∕h；MS1碰撞能量为4 eV；MS2碰撞能量为15 ～ 50 eV；MS1、MS2质量扫描范围均为m∕z50．0 ～ 1 200．0；实时校正液为亮氨酸脑啡肽（200 pg∕µL）。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择根据市面常见促进睫毛增长的产品基质类型，选用液体类基质样品对前处理条件进行优化。考察了甲醇、50%甲醇、乙腈、50%乙腈对9种PGF2α类化合物的提取效率，结果显示，上述溶剂对样品的提取结果无显著差异。考虑到乙腈与流动相体系一致，故选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 超声提取时间的选择以乙腈作为提取溶剂，采用空白基质加标的方式考察超声提取时间对回收率的影响。结果表明，超声提取时间为10 ～ 20 min时，9种目标物的回收率逐步增加；超声提取20 min后，9种目标物的回收率无明显差异。故选择超声提取时间为20 min。

2.2 色谱条件的优化

实验比较了水-乙腈、甲酸铵水溶液-乙腈、甲酸∕甲酸铵水溶液-乙腈3种流动相对9种PGF2α类化合物分离测定结果的影响。由于在流动相中加入质子和缓冲盐能够调节化合物的离子强度，得到较好的峰形及响应，为保证所有化合物均可出峰，选择甲酸∕甲酸铵水溶液-乙腈作为流动相以提高化合物的离子化效率与响应强度。考察了水相中加入不同浓度（1、2、5 mmol∕L）甲酸铵水溶液以及不同体积分数（0．01%、0．05%、0．1%）甲酸对分离结果的影响，经比较，最终确定选用2 mmol∕L甲酸铵水溶液（含0．05%甲酸）-乙腈作为流动相。

2.3 质谱条件的优化

采用电喷雾正负离子模式扫描，对9种PGF2α类化合物进行一级、二级质谱数据采集。结果显示，正离子模式下各化合物的响应强度高于负离子模式，因此选用正离子模式建立PGF2α类化合物的高通量筛查数据库。当MS1碰撞能量为4 eV时，各化合物均能获得响应值良好的母离子，多数化合物均能得到［M + H］+，其中部分化合物（比马前列素、比马前列素酸甲基酯、氯前列醇异丙基酯以及比马酰胺）的［M + H］+信号响应值较弱，产生信号响应值较好的［M + H-H2O］+。以比马前列素为例，响应值较好的［M + H-H2O］+是由于比马前列素分子结构中含有羟基，因而易脱水得到［M + H-H2O］+离子（见图2）。根据各化合物的一级质谱离子响应，选择相应的母离子。

图2 比马前列素［M + H］+、［M + Na］+、［M + H-H2O］+的提取离子流图Fig．2 ［M + H］+，［M + Na］+ and ［M + H-H2O］+extracted ion chromatogram of bimatoprost

在确定MS1碰撞能量的条件下，对二级质谱参数进行优化，设置MS2碰撞能量为15 ～ 50 eV，采集数据信息。以拉坦前列素为例，母离子脱去羟基产生m∕z379．263 1碎片离子，酯键断裂进而产生m∕z319．206 1碎片离子，进一步在不同位置断裂烃键产生m∕z209．132 5、131．085 1、189．127 3等碎片离子，而后逐级脱去1个碳产生m∕z105．069 8、91．054 2碎片离子。其中某些碎片离子在其他PGF2α类化合物的二级碎片图谱中均可发现，表明化学结构类似含有相同基本母核的PGF2α类化合物的裂解规律类似，从而产生相同的特征碎片。以拉坦前列素为例，推导质谱中化学键可能的断裂位置与裂解途径如图3所示。

图3 拉坦前列素的可能裂解途径Fig．3 Possible mass spectrometric cleavage pathways of latanoprost

2.4 PGF2α筛查数据库的建立

在优化条件下，采用UPLC-Q-TOF MS∕MS对9种PGF2α类化合物进行MSE数据采集。收集并整理化合物的名称、分子式、结构式、CAS号、保留时间、加合方式、精确分子量、碎片离子信息等参数，建立9种化合物的高通量筛查数据库（表1），用于化妆品中PGF2α类化合物的快速筛查。考虑到促进睫毛增长的化妆品多为液态水基类型，采用液态水基类化妆品样品进行空白加标实验，对高通量筛查数据库进行验证。根据欧盟96∕23∕EC指令［20］要求采用质谱对物质进行确认最少需要4个识别点，结果显示本文9种化合物均满足要求，所建立的数据库满足化妆品高通量筛查分析要求。

表1 9种PGF2α类化合物的数据库信息Table 1 Database informations of 9 PGF2α compounds

2.5 线性范围、检出限与定量下限

取“1．2．1”制备的9种PGF2α类化合物标准工作溶液适量，按上述色谱及质谱条件进行分析，以各化合物的质量浓度为横坐标（X，ng∕mL），对应的色谱峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。以信噪比S/N= 3时计算9种化合物的方法检出限（LOD），以S/N= 10时计算方法定量下限（LOQ）。表2结果显示，本方法9种化合物的检出限为0．075 ～ 0．75 µg∕g，定量下限为0．25 ～ 2．5 µg∕g，满足对化妆品进行快速定性筛查的日常检测需求。9种PGF2α类化合物在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0．99。

表2 PGF2α类化合物的线性关系、检出限与定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs of PGF2α compounds

2.6 实际样品筛查

采用所建立的数据库对48批睫毛用化妆品进行筛查分析，结果显示1批样品检出拉坦前列素，含量为4．89 µg∕g；4批样品检出比马前列素，含量分别为122．40、157．43、142．78、92．01 µg∕g。所测阳性样品中目标化合物与谱库中PGF2α数据信息比对，保留时间偏差小于0．1 min，质量偏差小于0．6 mDa，母离子和5个碎片离子的精确质量数以及结构比对一致，二级质谱图对比如图4所示。结果表明，所建立的筛查数据库能够快速识别可疑风险物质。

图4 比马前列素与拉坦前列素在溶剂（A、B）和化妆品样品（C、D）中的二级质谱图Fig．4 Secondary MS spectra of bimatoprost and latanoprost in solvent（A，B） and cosmetics sample（C，D）

3 结 论

本研究建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱高通量快速筛查睫毛用化妆品中PGF2α的方法，并结合各类化合物的色谱质谱采集信息，构建了9种PGF2α的高分辨筛查数据库。所建立的数据库能够用于化妆品中PGF2α的定性筛查分析，灵敏度高，分析速度快，完善补充了化妆品风险物质的筛查数据库，可为监管部门对化妆品中违禁组分的高通量快速筛查提供技术支撑。