QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定雷公藤及根际土壤中3种农药残留

李凤凤，张毅鹏，龚达林，刘三波，黄麒元，3，梅之南，王学奎，舒少华

1.华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070； 2.华润三九（黄石）药业有限公司，黄石 435000；3.国药集团中联药业有限公司，武汉 430070

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）是卫矛科（Cleastraceae）雷公藤属植物，是我国传统的中药材之一，其主要活性成分为萜类和生物碱类化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌、止痛等多种作用［1］。在雷公藤栽培过程中，白绢病、炭疽病、丽长角巢蛾等多种病虫害对其造成严重危害。目前，生产上多采用辛硫磷、氯氰菊酯、乙基多杀菌素等农药来防治丽长角巢蛾等害虫。其中，辛硫磷作为广谱、高效、低毒、易分解的杀虫剂，已经成为乐果、甲胺磷等高毒农药的替代产品［2］；氯氰菊酯是一种广谱性拟除虫菊酯类杀虫剂，对害虫具有触杀和胃毒作用［3］；乙基多杀菌素因低毒、低残留、作用位点独特、杀虫谱广，已经应用到了多种作物上［4］。雷公藤活性成分复杂，施用化学农药后农药残留会直接影响其药效，且长期摄入残留农药会对人体造成神经毒性、致癌、致畸等危害［5-6］。因此，农药残留量检测是雷公藤中药材质量控制的一项重要指标。

目前，常见的检测中药材中农药残留的方法主要包括色谱法、色谱-质谱联用技术、毛细管电泳法、免疫分析法和生物传感器技术等，其中色谱和质谱法在实际应用中比较广泛。中药材基质复杂，且待测农药大多数在高温下不稳定，所以液质联用技术成为了测定农药残留的主导技术［7-8］。

QuEChERS法是在固相萃取基础上开发的一种新型样品前处理技术［9］，最初针对一定含水量（>75%）的蔬果等样本中的农药进行提取，具有快速、便捷、廉价、高效、耐用和安全等特点，得到快速广泛应用。Lehotay等［10］利用QuEChERS法结合液质联用技术检测了蔬菜和水果中229种农药残留。为保证提取效率，学者根据样本特点和待提取物性质进行了多种改进和优化［11］。针对干燥或含水量较低的样品，向样品中添加适量的水，可提高样品的浸润性，弱化待测组分与样品基质之间的相互作用，使待测组分更容易在提取过程中被充分萃取［12-13］。

目前，针对我国雷公藤种植生产过程中常用的3种农药残留检测方法报道较少，且目前我国没有雷公藤药材中的农药残留标准。本研究通过快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱（QuECh‑ERS/UPLC-MS/MS）法测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药残留含量，并与相关国际标准进行对比，旨在为3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留检测提供方法指导， 并为我国尽快制订雷公藤中药材中的农药残留标准提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸铵（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯），中国武汉弗顿控股有限公司；乙腈和甲醇（质谱纯），美国Fisher公司；无水硫酸镁（MgSO4，分析纯），中国上海麦克林生化科技有限公司；氯化钠（NaCl，分析纯），德国BioFro公司；N-丙基乙二胺（PSA， 40～63 μm），美国Agela Technol‑ogies公司；乙基多杀菌素原药（100 mg，纯度为88.28%），德国Dr. Ehrensorfer公司；氯氰菊酯标准溶液（1 000 mg/L，丙酮中）和辛硫磷标准溶液（100 mg/L，丙酮中），坛墨质检科技股份有限公司。

雷公藤根样、土壤样品于2021年11月13日采集于湖北省阳新县平原村雷公藤种植基地 （115°E， 29°N）。随机取30株雷公藤作为检测植株样品，其中根样取自于所选定的雷公藤植株地下10～20 cm处，土样选择对应部位的根际土壤（黄棕壤，有机质17.88 g/kg，全氮0.46 g/kg，全磷0.86 g/kg，全钾6.29 g/kg，碱解氮84.35 mg/kg，速效磷25.92 mg/kg，pH 4.94）。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TSQ Altis™），美国Thermo Fisher Scientific公司；色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美国Waters公司；FW80高速粉碎机、101-AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；BX3200H超声波清洗仪，上海新苗医疗器械制造有限公司；AR223CN分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；B-20R型冷冻离心机，德国NACHT公司；MX-S型旋涡混合器，美国Scilogex公司。

1.3 样品前处理

将雷公藤根样洗净，擦净表面水分后于65 ℃烘箱中烘干6 h，粉碎，过孔径230 μm筛，试验前于65 ℃烘箱中烘干4 h，备用。土壤样品自然风干，除去碎石、杂草和植物根茎等杂物，过孔径280 μm筛，备用。准确称取雷公藤根样和土壤样品各2 g（精确至0.01 g），分别置于50 mL 离心管中，各加入去离子水4 mL，充分浸润后，加入乙腈4 mL，涡旋混匀1 min，超声30 min后依次加入氯化钠0.4 g和无水硫酸镁1.6 g，再次涡旋2 min后4 000 r/min离心5 min。精密量取上清液2 mL于15 mL离心管中，分别加入N-丙基乙二胺0.1 g和无水硫酸镁0.3 g，旋涡1 min，于4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机膜，待测。

1.4 标准溶液的配制

乙基多杀菌素标准储备溶液：准确称取乙基多杀菌素标准品10 mg（精确至 0.1 mg）至10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，摇匀，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，在4 ℃冰箱中保存，待用。空白基质溶液：分别准确称取未施药的雷公藤根样和土壤样品各2 g（精确至0.01 g），按照本文“1.3”方法进行样品前处理，得到根样空白基质溶液和土壤空白基质溶液。空白基质标准工作溶液：用空白基质溶液分别稀释3种农药标准品溶液，配制一系列浓度的空白基质标准工作溶液，用于做基质匹配校准工作曲线。

1.5 超高效液相色谱-串联质谱检测条件

色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；进样量1 μL；流速0.4 mL/min；流动相 A：乙腈；流动相B：5 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0 min，5% A，95% B；10 min，99% A，1% B；13 min，99% A，1% B；13.1 min，5% A，95% B；15 min，5% A，95% B。

质谱条件：Thermo Fisher超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TSQ Altis™）检测，电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；正离子扫描模式；选择反应监测模式（selective reaction monitoring，SRM）；毛细管电压3.5 kV；离子传输线温度325 ℃；雾化温度350 ℃；辅助气和鞘气均为N2，辅助气流速10 mL/min；鞘气流速40 mL/min。优化后的各目标化合物的质谱参数见表1。

表1 辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of phoxim，cypermethrin and spinetoram

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱检测条件的优化

考察了2种超高效液相色谱柱Waters ACQUI‑TY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）在乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液2种流动相和梯度洗脱条件下分离目标物的情况。3种农药在不同的色谱柱和流动相条件下的保留时间、峰形和分离情况见表2。结果表明，采用乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液为流动相，在本文“1.5”的梯度洗脱条件下，使用HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm ）色谱柱，15 min内3种农药均可得到较高的灵敏度、峰形和重现性。其中乙基多杀菌素的2种本体乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L能达到较好分离，符合系统适用性的要求。

表2 4种色谱条件下化合物的保留时间、峰形和分离度情况Table 2 Retention time， peak shape and resolution of compounds under four different chromatographic conditions

2.2 线性范围、检出限与定量限分析

按照本文“1.4”方法配制一系列空白基质标准工作溶液，以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），线性回归分析，拟合得各农药的基质匹配线性回归方程以及相关系数。如表3所示，在根样空白基质和土壤空白基质中，辛硫磷（0.5～100.0 ng/mL）、氯氰菊酯（5～2 000 ng/mL）、乙基多杀菌素-J（0.01～1 000.00 ng/mL）、乙基多杀菌素-L（0.1～1 000 ng/mL）的线性关系良好，相关系数均大于0.999。为最大程度消除基质效应的影响，保证检测的准确性，在实际样品检测中采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

以信噪比（S/N）为10和3时对应的空白基质标准溶液的浓度为定量限（LOQ）和检出限（LOD），3种农药的定量限和检出限结果如表3所示，均远低于相关国际标准中3种农药在药用植物中的最大残留限量（MRL）（表4）。结果证明本研究建立的QuEChERS/UPLC-MS/MS方法灵敏度高，可满足实际定量检测需求。

表3 3种农药的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equations， correlation coefficients， LODs and LOQs of three pesticides

表4 国内外标准体系中3种农药的最大残留限量Table 4 The maximum residue limits of three pestcides in domestic and foreign standard systems mg/kg

2.3 方法的回收率与精密度分析

3种农药在雷公藤根和土壤样中的回收率试验结果见表5。参考3种农药在国内外标准体系中的最大残留限量，每种农药设定 3个添加水平，分别加入到不含农药残留的雷公藤根样和土壤样品（未施药）中，每个水平平行6次，计算得出平均加样回收率在85.22%～113.08%，相对标准偏差（RSD）为2.56%～5.67%，均符合农药残留检测的技术标准。

表5 3种农药在雷公藤根和土壤样中的平均回收率和相对标准偏差（n=6）Table 5 Average recoveries and RSDs of three pesticides in roots and soil samples （n=6）

2.4 雷公藤样品和土壤样品中3种农药残留检测

对采集于华润三九（黄石）药业有限公司雷公藤GAP种植示范基地（湖北省阳新县平原村）的雷公藤根部样品和土壤样品各30份进行检测，结果见表6。由表6可见，土壤样品中辛硫磷、乙基多杀菌素、氯氰菊酯的残留量均未检出；根部样品中辛硫磷的残留量为0.010～0.037 mg/kg，乙基多杀菌素-J的残留量为

表6 雷公藤根样和土壤样品中3种农药残留量检出范围Table 6 Detected range of three pesticides residues in real samples mg/kg

3 讨论

本研究检测的3种农药是雷公藤种植过程中最常用的农药，其中辛硫磷属于有机磷类农药，见光易分解、残留期短、残留危害小，适合施入土中，防止地下害虫。乙基多杀菌素（XDE-175-J， XDE-175-L）是多杀菌素类的杀虫剂，具有生物农药的安全性和化学农药的速效性，主要降解方式是光解和微生物降解，最终分解为碳、氮、氧等［14］。氯氰菊酯是广谱性的菊酯类杀虫剂，广泛应用于中药材的生产、运输和储存过程，其残留超标会对人体造成神经毒性和生殖内分泌毒性，这类农药超标较为严重的中药材是菊花、金银花和枸杞等［7］，但目前氯氰菊酯在雷公藤种植过程中的残留情况很少见相关报道。

QuEChERS前处理方法，操作简便，耗时短，溶剂少；UPLC-MS/MS检测方法线性关系良好，检出限和定量限均较低，具有较高的灵敏度和准确度，且串联质谱的选择反应监测（SRM）模式能较好地避免干扰，二者联合可满足定性和定量检测要求。QuEChERS/UPLC-MS/MS法的不足之处是需要使用较为贵重的超高效液相色谱-串联质谱仪，仪器操作相对复杂。

采用QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定雷公藤及根际土壤中3种农药残留，在实际样品的检测结果中，土壤样品中3种农药残留均未检出，说明在雷公藤的种植过程中科学规范使用辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药不会对雷公藤根际土壤造成残留污染。雷公藤根部样品中辛硫磷和乙基多杀菌素的残留量较低，均低于GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对药用植物枸杞（干）规定的最大残留限量（2 mg/kg），同时也低于《美国药典-国家处方集》（USP40-NF35）、《欧盟药典》（EP 9.2）和《日本药典》（JP 17）中规定的2种农药的最大残留限量（0.01 mg/kg）。张治科等［15］采用液相色谱法测定辛硫磷在甘草中的残留量，最低检出限为5.0 μg/kg。本研究建立的UPLC-MS/MS检测技术最低检出限为12.5 ng/kg，灵敏度更高。实际检测结果表明雷公藤根部样品中辛硫磷的残留量均较低，说明在雷公藤的种植过程中科学规范使用辛硫磷不会对中药材造成残留污染。GB 2763-2021中对药用植物只规定了枸杞（干）中氯氰菊酯的最大残留限量（2 mg/kg），《中国药典》未对药用植物中氯氰菊酯的残留限量做出规定，一些国外的标准体系中制定了药用植物中氯氰菊酯的最大残留限量标准，其中《美国药典-国家处方集》（USP40-NF35）、《欧盟药典》（EP 9.2）和《日本药典》（JP 17）中规定的最大残留限量为1.0 mg/kg，《韩国药典》（KP10）中规定的最大残留限量为0.5 mg/kg。杨红兵等［16］采用气相色谱法测定了枸杞中氯氰菊酯的残留量，检出限是4.360 μg/kg，而本研究建立的方法检出限是0.714 μg/kg，灵敏度更高。实际样品检测结果中，氯氰菊酯在土壤样品中未检出，但在雷公藤根部样品中残留量在2.940～6.540 mg/kg，表明雷公藤可能对氯氰菊酯具有富集作用。

本研究建立的检测方法和实际样品检测结果，为制定3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留限量标准提供了分析方法，对雷公藤种植过程中常用农药的风险监控具有一定的指导作用。但本研究只测定了乙基多杀菌素2种本体乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的残留量，为更加严格控制残留，后续研究应增加2种代谢物N-脱甲基-乙基多杀菌素-J（Ndemethyl-XDE-175-J）和N-甲酰基-乙基多杀菌素-J（N-formyl-XDE-175-J）的残留量检测［17］。同时应继续深入研究氯氰菊酯在雷公藤中的残留动态和富集情况，确定其在雷公藤上的使用剂量、施用方式、安全间隔期和安全采收期等，为科学评价该农药在雷公藤上应用的残留风险提供依据，同时应参考国外相关标准，结合中国雷公藤种植实际情况，尽快制定出更完善的农药残留限量标准。