羧基化多壁碳纳米管分散固相萃取－三重四极杆气质联用法测定茶叶中16种农药残留量

林金俗，荣杰峰，张松艳，乐有东，龚慧婷，张志勇，佘紫文

1.福建八马茶业有限公司，福建 泉州362000；2.泉州海关综合技术服务中心，福建 泉州362000

茶叶是一种重要的饮料产品，目前我国是世界上最大的茶叶生产国和茶叶消费国，为保障茶叶的产量和质量，常规生产中多使用喷施农药的手段进行病虫害的防治，从而导致茶叶中存在农药残留的可能。对农药制定最大残留限量，是加强农药残留风险管理的重要技术手段，也是世界各国的通行做法。我国最新版《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）中对茶叶中农药的残留限量指标已达到106项，其中烯虫乙酯、烯虫炔酯等17种农药残留尚未规定检测方法或参考方法[1]。GB 2763—2021推荐的气相色谱分离的检测方法标准中，乐杀螨[2]、丙酯杀螨醇[3]、灭草环[3]、抑草蓬[3]、百菌清[4]、氯酞酸甲酯[5]指定的是参考果蔬的气质联用检测标准方法，毒虫畏[6]、茚草酮[7]指定的是参考粮谷的气质联用检测标准方法，巴毒磷[8]采用气相色谱法，虫螨腈[9]采用气质联用法，烯虫乙酯、烯虫炔酯、草枯醚、氟除草醚、格螨酯和环螨酯6种农药目前尚无茶叶中的检测方法；该16种农药中仅百菌清和虫螨腈为茶园登记用药，其余14种农药尚未在我国取得登记，为GB 2763—2021新增农药品种。以上16种农药的方法标准和文献方法相对繁杂，使用仪器设备多，不便于检测人员的使用，目前国内外关于茶叶中该16种农药的同时检测方法尚未见报道。

与单四极杆气质联用仪相比，气相色谱－三重四极杆质谱联用仪（Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）因 可获得更丰富的离子碎片信息而拥有更高的灵敏度、更强的抗干扰能力和更强的定性能力，目前已广泛应用于茶叶[10-15]、粮谷[16-17]、动物源性食品[18]等基质样品中目标化合物的分析检测。

本研究选择以上16种农药为研究对象，以羧基化多壁碳纳米管（Carboxylated multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs-COOH）为主要净化材料，结合GC-MS/MS技术，建立了一种通用性强、选择性好、灵敏度高的快速测定茶叶中16种农药残留的GC-MS/MS方法，为相关方法的修订完善提供有意义的借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Thermo 1300-TSQ9000三重四极杆气质联用仪（美国赛默飞世尔科技）：配备电子轰击源（EI）。

无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠、乙腈、丙酮和正己烷均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯（色谱纯），购于美国TEDIA公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA，40～60μm）、石墨化碳黑（GCB，40～120μm）和十八烷基键合硅胶（C18，40～60μm）购于上海安谱试验科技股份有限公司，羧基化多壁碳纳米管（长度10～30μm，外径10～20 nm，内径5～10 nm，纯度＞95%，比表面积＞200 m2/g）购于北京德科岛金科技有限公司；标准物质从坛墨质检科技股份有限公司购得[11-12]。

标准溶液：首先用乙酸乙酯配制一定浓度的混合标准中间溶液，再根据需要用乙酸乙酯和空白样品提取液稀释得系列标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

准确称取2 g茶叶试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL饱和食盐水，涡旋混匀后静置30 min；随后加入10 mL乙酸乙酯，漩涡振荡提取5 min；4 000 r/min离心3 min。准确吸取0.9 mL茶叶提取液于2 mL聚丙烯离心管中，加入25 mg PSA、50 mg MWCNTs-COOH、150 mg MgSO4和0.1 mL甲苯；涡旋混合1 min，取上清液过0.22μm有机滤膜，用于测定[19-20]。

1.2.2 色谱条件

进样口温度：280℃；不分流进样，进样量：1μL；恒流模式，流量为1.0 mL/min；TG-5SILMS毛细管色谱柱，规格：30 m×0.25 mm×0.25μm；柱箱升温程序：70℃（0 min），以25℃/min升温至240℃（0 min）；最后以10℃/min升温至310℃（2 min）[19-20]。

1.2.3 质谱条件

电子轰击源：70 eV；离子源温度：300℃；传输线温度：280℃；多反应监测（SRM Timed）模式：16种农药的质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

在合适的质量数范围内，分别对10.0 mg/L的16种农药标准溶液进行全扫描；选择质量数较大并且响应较高的离子进行二级碎裂，采用Auto SRM软件对二级碎裂碰撞电压进行优化。16种农药定量离子对、定性离子对及碰撞能量见表1。

表1 16种农药的保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞能量

2.2 前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂的选择

根据待测农药的极性和溶解程度，试验选择乙腈、正己烷-丙酮（7∶3）和乙酸乙酯为提取溶剂，将添加有20μg/kg 16种农药的全发酵（红茶）、半发酵（乌龙茶）、不发酵（绿茶）茶按照“1.2.1”进行提取净化后上机检测，使用乙腈提取时进行溶剂置换后上机，用溶剂标准工作曲线进行校正，每种样品平行处理3次。3种提取溶剂对16种农药均可获得80%以上的回收率，但采用乙腈为提取溶剂时需要进行溶剂置换，氮吹等过程可能导致目标物质的损失且过程繁杂；使用正己烷-丙酮（7∶3）提取时提取液的颜色较深，提取的色素等共提取杂质较多将不利于后续净化，所以，为获得更好的方法准确性，同时考虑操作更加便捷，最终选择乙酸乙酯作为提取溶剂。图1为不同茶类在乙酸乙酯为提取溶剂时16种农药残留的提取回收率，不同茶类样品中16种农药均获得90%以上提取回收率，其中巴毒磷、抑草蓬及乐茶螨的回收率较高，超过200%。

图1 乙酸乙酯为提取溶剂时不同茶类中16种农药的提取回收率

2.2.2 甲苯用量的选择

试验发现，具有平面结构的百菌清容易被MWCNTs-COOH吸附，为了获得准确的检测结果，在净化前向提取溶液中加入一定量的甲苯再进行净化[11-12]，被吸附的百菌清可以解析出来，而其他农药受影响的程度较小。考察了甲苯用量（0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL）对百菌清净化回收率的影响。结果显示，随着甲苯用量的增加，百菌清的净化回收率呈增大趋势，当加入量为0.10 mL时，百菌清的净化回收率即可恢复至100%左右，继续增大甲苯用量，净化回收率变化不明显，但方法的检测限将受到影响，所以最终选择甲苯用量为0.10 mL。

2.2.3 吸附剂种类的选择

试验考察了50 mg PSA、C18、GCB、MWCNTs-COOH等4种净化吸附剂对乌龙茶提取液中色素的去除效果。结果显示，PSA和C18对色素的吸附能力较差，净化后溶液颜色变化较小仍呈墨绿色，经GCB吸附剂净化后呈黄绿色，经MWCNTs-COOH净化后乌龙茶提取液呈浅黄绿色。试验结果表明MWCNTs-COOH对色素的净化效果最好；PSA对色素的去除能力较弱，但能有效去除茶多酚、儿茶素类和糖类物质。茶叶基质比较复杂，不同类别（全发酵、半发酵和不发酵）的茶类基质区别较大，所以使用分散固相萃取净化时需要考虑两种或多种吸附净化剂，以更有效除去提取液中的色素、茶多酚、儿茶素和糖类等杂质成分，因此，本研究选择MWCNTs-COOH和PSA为净化吸附剂。

2.2.4 吸附剂用量的选择

为获得较好的样品净化效果，以目标物回收率为考察依据对吸附剂用量进行考察。以加标水平20μg/kg的乌龙茶为基质，按“1.2.1”方法前处理，比较了不同吸附剂组合的净化效果及其对目标物回收率的影响，吸附剂组合加入MgSO4除水。图2为不同吸附剂组合净化后16种农药的回收率情况。结果显示，PSA净化后目标物回收率变化较小；随MWCNTs-COOH的加入，大部分目标物回收率呈一定的下降趋势；其中巴毒磷、抑草蓬和乐杀螨的回收率在MWCNTs-COOH的净化作用下有较大程度的下降；但在MWCNTs-COOH的用量达到20 mg以上后，随着MWCNTs-COOH用量继续加大回收率变化变缓，部分农药回收率仍然较高，说明基质效应仍然明显。当MWCNTs-COOH用量为50 mg时，乌龙茶提取液颜色为浅黄绿色，红茶和绿茶的提取液接近无色，最终结合色素清除效果、回收率和经济效应，选择25 mg PSA+50 mg MWCNTs-COOH+150 mg MgSO4为本方法的吸附剂组合用量。

图2 不同吸附剂组合对加标空白样品提取回收率的影响

2.3 基质效应

基质效应（ME）在气相系统中主要表现为“基质诱导色谱响应增强现象”，即基质增强效应；通过合适的净化方法和优化进样方式等手段可以减小气相系统在检测过程中出现的基质效应,但无法将其彻底消除[21-22]。本研究采用公式：基质效应（ME）=[（基质匹配校准曲线斜率／纯溶剂标准曲线率）－1]×100%对基质效应进行评估，中等程度以上的基质效应须采取措施补偿[23]。16种农药在红茶、绿茶和乌龙茶中的基质效应如图3所示，结果表明，百菌清、氯酞酸甲酯、格螨酯、环螨酯、烯虫乙酯和丙酯杀螨醇在3种茶叶中为弱基质效应；其余10种农药在3种基质中基质效应为中等程度以上，特别是巴毒磷、抑草蓬、乐杀螨3种茶叶的基质效应较强，因通过净化的手段无法完全克服所有基质的基质效应，为了提高检测方法的准确性，本研究采用基质匹配校准的方法进行基质效应的补偿。

图3 16种农药在不同茶叶基质中的基质效应

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、相关系数和方法检测限

按照研究建立的方法处理得空白基质溶液，配制基质标准工作溶液，按“1.2”的色谱质谱条件进行检测，得到线性方程和相关系数，以S/N=10确定方法定量限（LOQ），相关数据见表2（线性方程为乌龙茶基质中获得）。结果显示，16种农药的基质标准工作液在各自范围内均呈良好的线性关系，方法定量限为0.5～10.0μg/kg，16种化合物的定量限均小于等于GB 2763—2021中限量要求。

表2 16种农药的回归方程、相关系数、线性范围和定量限

2.4.2 回收率和精密度

分别对红茶、绿茶和乌龙茶空白样品进行了不同浓度的加标回收试验，样品添加混合标准溶液后，振荡混匀并静置1 h，以便添加的农药能被样品充分吸收，按照“1.2”方法进行前处理和仪器测定，平行处理6次。16种农药在不同茶叶基质中的添加浓度及平均回收率见表3，红茶、绿茶及乌龙茶空白样品在4个水平加标回收试验中的平均回收率为71.2%～128.2%，相对标准偏差（n=6）为2.3%～9.2%。

表3 不同茶叶中16种农药4个水平添加量的平均加标回收率和相对标准偏差(n=6)

2.4.3 实际样品检测

用本方法对福建省泉州市范围内采集的50份样品（其中红茶10份、绿茶10份、乌龙茶30份）进行检测，其中虫螨腈检出5项次，检测值为0.15～0.58 mg/kg；百菌清检出3项次，检测值0.04 5～0.13 mg/kg。检测值均远低于GB 2763—2021限量要求，说明茶叶质量安全整体情况相对良好。

3 小结与讨论

本研究建立了茶叶中16种农药残留量的快速检测分析方法，茶叶样品经乙酸乙酯提取，提取液用MWCNTs-COOH和PSA净化，经三重四极杆气质联用仪测定，基质匹配外标法定量。建立的方法简单、快速、灵敏度高、准确度好，能满足茶叶中相关农药残留的检测要求。