非小细胞肺癌组织中TRIM59、p53表达与临床病理特征及预后的相关性分析

王现生，于红艳，郭小燕 (河北工程大学附属医院呼吸与危重症二科，河北 邯郸 056000)

肺癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，其发病率与病死率均居恶性肿瘤首位[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要组织学类型，占所有肺癌的80%～85%，随着医学技术的发展，NSCLC的早期诊断和治疗已取得进展，然而NSCLC患者5年生存率仍然较低[2]。研究与NSCLC临床病理特征及预后有关的因子有助于发现有效的生物标记物，以减少NSCLC患者预后不良的发生。三重基序蛋白(tripartite motif protein，TRIM)参与细胞增殖、转录调节、免疫、癌症发生等多种细胞生物学过程，其中TRIM59与NSCLC的发生发展及预后有关[3]。p53是一种抑癌基因，野生型p53能够通过诱导癌细胞凋亡发挥抑癌作用；在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现p53基因的突变，p53基因突变后，其空间构象也发生改变，使其失去对细胞生长、凋亡和DNA修复的调控作用，在肿瘤的发生发展中具有重要作用[4-5]。另有研究显示，TRIM59、p53可共同影响顺铂在食管癌细胞中的敏感性[6]。但目前关于TRIM59与p53联合作用在NSCLC组织中的表达情况尚不明确，因此本研究通过分析NSCLC组织及癌旁组织中TRIM59、p53的表达，探讨二者与NSCLC临床病理特征及预后的关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2014年5月至2016年5月在我院诊断为NSCLC的73例患者为研究对象，其中男41例，女32例；年龄30～81岁，平均(63.25±8.69)岁；有吸烟史47例，无吸烟史26例；鳞癌31例，腺癌38例，其他4例。纳入标准：①经组织病理学检查确诊为NSCLC；②在我院进行手术治疗，且癌组织及癌旁组织齐全；③术前未进行放化疗；④一般资料完整。排除标准：①合并心、肝、肾等严重疾病；②患有自身免疫性疾病；③合并其他恶性肿瘤。根据国际肺癌研究协会公布的第八版肺癌TNM分期标准[7]对NSCLC患者进行临床分期，其中Ⅰ期21例，Ⅱ期36例，Ⅲ期16例。根据WHO肺癌病理学分类对患者进行分级，其中低分化23例，中分化34例，高分化16例。

通过电话或门诊复查的方式对患者进行随访，记录患者生存状态。随访60个月，随访截止日期为2021年7月30日，患者死亡日期或随访截止日期作为终点事件时间。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人TRIM59蛋白(批号：ab69639)、p53蛋白(批号：ab32389)单抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG(批号：ab150077)购自艾博抗(上海)贸易有限公司；DAB显色试剂盒(批号：ZLI-9017)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TRIzol试剂盒购自上海通蔚生物有限公司；逆转录试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司。

1.3 免疫组织化学法检测TRIM59、p53蛋白表达

NSCLC组织及癌旁组织常规石蜡包埋保存。经脱蜡、抗原修复、封闭后加入兔抗人TRIM59、p53蛋白单抗，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG(稀释比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，加入DAB显色试剂盒进行染色，苏木素复染，盐酸酒精短暂分化后脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：由2名具有5年以上工作经验的病理医师根据双盲法对染色结果进行半定量评分，以细胞质或细胞核内出现黄色或棕色颗粒为阳性。采用染色指数(stain index，SI)进行评分，SI=阳性细胞率评分×阳性细胞染色强度评分，其中SI≤3分为阴性，SI>3分为阳性。阳性细胞率评分：无阳性细胞记为0分，阳性细胞率<25%记为1分,阳性细胞率为25%～50%记为2分,阳性细胞率为51%～75%记为3分,阳性细胞率>75%记为4分。阳性细胞染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，黄褐色为2分，棕褐色为3分。

1.4 qRT-PCR检测TRIM59、p53 mRNA表达

按照TRIzol试剂盒及逆转录试剂盒说明书提取总RNA，并逆转录为cDNA。TRIM59 mRNA以GAPDH为内参进行PCR反应，p53 mRNA以β-actin为内参进行PCR反应，引物序列见表1。具体反应条件为：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算出TRIM59、p53 mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 NSCLC组织及癌旁组织中TRIM59、p53蛋白的表达

NSCLC组织中TRIM59蛋白阳性表达率为 74.0%(54/73)，高于癌旁组织的9.6%(7/73)，差异有统计学意义(χ2=62.201，P<0.001)。NSCLC组织中p53蛋白阳性表达率为65.8%(48/73)，高于癌旁组织的5.5%(4/73)，差异有统计学意义(χ2=55.859，P<0.001)，见图1。

a：TRIM59蛋白在癌旁组织中的表达；b：TRIM59蛋白在NSCLC组织中的表达；c：p53蛋白在癌旁组织中的表达；d：p53蛋白在NSCLC组织中的表达图1 TRIM59、p53蛋白在癌旁组织及NSCLC组织中的表达(×200)

2.2 NSCLC组织及癌旁组织中TRIM59 mRNA、p53 mRNA的表达

与癌旁组织比较，NSCLC组织中TRIM59、p53 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 NSCLC组织及癌旁组织中TRIM59、p53 mRNA的表达

2.3 TRIM59及p53蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

NSCLC组织中TRIM59蛋白阳性表达54例，阴性表达19例；p53蛋白阳性表达48例，阴性表达25例。NSCLC组织中TRIM59、p53蛋白阳性表达与患者的年龄、性别、吸烟史、淋巴结转移、组织学类型无关(P>0.05)，与患者的TNM分期、组织分化有关(P<0.05)，见表3。

表3 TRIM59、p53蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系(例)

2.4 NSCLC组织中TRIM59 mRNA与p53 mRNA表达的相关性

NSCLC组织中TRIM59 mRNA表达与p53 mRNA表达呈正相关(r=0.360，P=0.002)，见图2。

图2 NSCLC组织中TRIM59 mRNA与p53 mRNA表达的相关性

2.5 TRIM59、p53蛋白表达与NSCLC患者预后的关系

采用TCGA数据库分析TRIM59、p53蛋白与NSCLC患者预后的关系，共纳入494例，其中TRIM59高表达125例，TRIM59低表达369例，p53高表达124例，p53低表达370例。结果显示，TRIM59高表达患者与低表达患者的预后比较差异无统计学意义(P>0.05)，p53高表达患者与低表达患者的预后比较差异也无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 TCGA数据库分析TRIM59、p53蛋白与NSCLC患者预后的关系

对NSCLC患者进行随访，5年内共有46例患者死亡，生存率为37.0%。TRIM59蛋白阳性表达患者5年生存率(31.5%)低于阴性表达患者(52.6%)；p53蛋白阳性表达患者5年生存率(29.2%)低于阴性表达患者(52.0%)，见图4。

图4 Kaplan-Meier法分析TRIM59蛋白、p53蛋白与NSCLC患者预后的关系

2.6 COX回归分析影响NSCLC患者预后的危险因素

单因素COX分析表明，年龄、吸烟史、淋巴结转移、TNM分期、组织分化、TRIM59蛋白表达、p53蛋白表达均是影响NSCLC患者预后的因素(P<0.05)，见表4；多因素COX分析表明，TNM Ⅲ期、低分化、TRIM59蛋白阳性表达、p53蛋白阳性表达均是影响NSCLC患者预后的独立危险因素(P<0.001)，见表5。

表4 影响NSCLC患者预后的单因素COX分析

表5 影响NSCLC患者预后的多因素COX分析

3 讨论

肺癌是原发于气管、支气管和肺部的恶性肿瘤，主要包括小细胞肺癌、肺鳞癌、肺腺癌和大细胞肺癌几种类型。随着人们生活方式及习惯的改变，肺癌的发生率逐渐升高，严重威胁人类健康。目前肺癌的发病机制尚不清楚，吸烟、饮食、遗传、空气污染、职业等因素均与肺癌的发生有关。临床主要根据患者肿瘤病理类型、临床分期、淋巴结转移等对患者进行针对性治疗。临床分期和组织分化是肺癌患者重要的临床病理特征，是影响肺癌患者预后的重要因素。进一步明确与NSCLC有关的临床病理特征，可能对改善NSCLC患者不良预后具有重要意义。

TRIM蛋白由一系列高度保守的基序蛋白组成，这些蛋白含有RING结构域、B-box基序及一个卷曲螺旋区域[8]。大多TRIM蛋白是E3泛素连接酶，能够促进各种底物的翻译后修饰，从而影响细胞的生长、发育、分化、凋亡、炎症等过程[9]。TRIM59蛋白表达不仅与肿瘤细胞的恶性行为有关，也与肿瘤患者的临床病理特征有一定关系。Han等[10]研究表明，TRIM59通过影响BECN1的转录和泛素化在NSCLC的自噬调节中起重要作用。Ying等[11]研究表明，在肝细胞癌组织中TRIM59表达上调，TRIM59可通过降解蛋白磷酸酶1B促进肝细胞癌的肿瘤生长并调节细胞周期。本研究结果表明，NSCLC组织中TRIM59蛋白阳性表达率、TRIM59 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，且TRIM59蛋白阳性表达与NSCLC患者的TNM分期、组织分化有关，提示TRIM59蛋白与NSCLC的发生发展有关，原因可能是TRIM59可促进NSCLC细胞的增殖及迁移，进而影响NSCLC的发生发展。本研究还发现，TRIM59蛋白阳性表达NSCLC患者的5年生存率显著低于阴性表达患者，且COX回归分析表明TRIM59蛋白阳性表达是影响NSCLC患者预后的独立危险因素，提示TRIM59可能是NSCLC预后的预测因子和潜在的治疗靶标。

抑癌基因p53可通过调节细胞凋亡、衰老及细胞周期等生物学过程在预防肿瘤的发生中起关键作用[12]。韩璐等[13]研究表明，胃癌组织中p53阳性表达与患者淋巴结转移及分化程度有关。本研究结果显示，NSCLC组织中p53蛋白阳性表达率、p53 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，且p53蛋白阳性表达与患者的TNM分期及组织分化有关，提示p53蛋白表达与NSCLC的发生及临床病理特征有关，这可能是由于突变型p53蛋白与野生型p53蛋白结合，导致野生型p53蛋白抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的能力减弱，半衰期增加，因此NSCLC组织中p53蛋白阳性率高于癌旁组织[14]。本研究对患者进行了5年随访，结果表明p53蛋白阳性表达患者5年生存率低于阴性表达患者；COX回归分析显示，p53蛋白阳性表达是影响NSCLC患者预后的独立危险因素，提示p53蛋白可能与NSCLC患者的预后有关，与以往研究结果一致[15-16]。但是本研究结果与TCGA数据库分析结果不一致，TCGA数据库分析显示，TRIM59、p53高表达患者与低表达患者的预后情况比较差异均无统计学意义，这可能是由于数据库分析样本较多，人群不同，而本研究样本量较小，且为单中心研究，故研究结果还有待深入分析。

Liu等[6]研究表明，阻断TRIM59可通过上调p53而增强食管癌细胞对顺铂的化疗敏感性。但是NSCLC患者组织中TRIM59与p53的关系目前尚不明确。有研究发现，NSCLC细胞系中TRIM59蛋白呈高表达趋势，而敲除TRIM59后p53蛋白表达水平无显著变化，因此该研究认为TRIM59可能通过DNA合成后期，逐渐进入分裂期，而不是通过影响p53信号通路促进癌细胞的生长和迁移[3]。本研究对NSCLC患者组织中TRIM59、p53 mRNA表达水平进行了相关性分析，结果表明二者表达呈正相关，说明TRIM59 mRNA与p53 mRNA可能共同参与NSCLC进展过程，但具体的内在机制还需深入分析。

综上所述，TRIM59、p53蛋白表达与NSCLC患者TNM分期、组织分化及预后有关，二者可能通过某一机制影响NSCLC患者的发展及预后。但本研究仅对NSCLC组织及癌旁组织TRIM59、p53蛋白和mRNA表达进行了分析，还需通过细胞实验或动物实验进一步验证二者在NSCLC发生发展中的作用。