miR-27b-3p通过靶向抑制HIF1AN调控颈脊髓损伤后骨质疏松症大鼠的成骨分化

王 汉，黄友华，符林雄，王 乐 (海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

颈脊髓损伤是世界难治性病症，呈高发生率和高致残率等特点[1-2]。骨质疏松症是颈脊髓损伤的常见并发症和主要危险因素[3-4]。因此，急需探讨颈脊髓损伤后骨质疏松症(cervical spinal cord injury caused osteoporosis,CSCI-OP)的发病机制并探索针对性治疗方法以避免颈脊髓损伤后发展为骨质疏松症。微小RNA(microRNA,miRNA)普遍存在于生物体内，在结构、功能和进化上具有高度保守性，是调节其他功能基因表达的重要分子。miRNA还可以调控骨质疏松症中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化[5]，但具体机制的研究尚处于初始阶段。miR-27b-3p是一种重要的干细胞分化和细胞凋亡调节miRNA，研究已证实miR-27b-3p能通过特异性下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ促进MSCs的成骨分化[6]。然而，miR-27b-3p在CSCI-OP中的调控作用并不明确。本研究在体外和体内研究miR-27b-3p对MSCs成骨分化的调节，并通过CSCI-OP大鼠模型验证miR-27b-3p及其靶基因缺氧诱导因子1α抑制剂(hypoxia-inducible factor 1 α inhibitor,HIF1AN)对成骨分化的影响，并探讨其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

大鼠MSCs(CP-R131细胞)购于武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM、青霉素、链霉素购于美国GIBCO公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于美国Merck Millipore公司。重组大鼠骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP2)购于美国Sigma公司。miR-27b-3p抑制剂(miR-27b-3p inhibitor)及其阴性对照(NC inhibitor)、miR-27b-3p拟似物(miR-27b-3p mimic)及其阴性对照(NC mimic)均购于上海吉玛公司。HIF1AN过表达质粒(HIF1AN-OE)及其阴性对照(NC-OE)构建于上海吉玛公司。茜素红染色试剂盒购于上海Beyotime公司。Lipofectamine 2000购于美国Thermo Fisher Scientific公司。RIPA裂解缓冲液购于上海Beyotime公司。TRIzol试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司。TransScript和cDNA合成试剂盒购于北京天根生物有限公司。Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit购于美国ABclonal公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)购于上海Beyotime公司。GAPDH(#97166)购于美国Cell Signaling Technology公司。HRP偶联的亲和山羊抗小鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)二抗(SA00001-1)购于美国Protein Tech Group公司。PVDF膜购于美国MedChemExpress公司。Runx2(8486S)的一抗购于美国Cell Signaling Technology公司。HIF1AN(批号：20210307)、ALP(批号：202107007)、OPN(批号：20211028)的一抗购于北京生工生物公司。60只SD大鼠购于海南药物研究所有限责任公司(许可证号：SCXK2020-0007)。

1.2 CSCI-OP患者的临床标本

本研究纳入CSCI-OP患者30例作为CSCI-OP组，同时纳入健康体检者50例作为对照组，收集研究对象的外周血标本。经统计学分析2组性别、年龄、体质量、身高等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。临床标本的研究经我院伦理委员会审批通过(2020-1595LC)，受试者均对本研究知情同意。CSCI-OP组患者纳入标准：符合颈脊髓损伤后骨质疏松症的临床诊断标准；伴不同程度的颈椎节段疼痛表现；经X射线骨密度测定仪检测颈椎骨密度T-Score≤-2.5 SD；碱性磷酸酶、钙、磷值经生化检测在正常范围内。排除标准：有内分泌疾病、类风湿性关节炎等；长期服用糖皮质激素、孕激素、雄激素、雌激素、异黄酮、双膦酸盐以及降钙素等影响骨代谢的药物；患有严重神经系统、心脏系统或消化系统疾病；血压>160/95 mmHg；存在糖尿病史；过敏体质以及对雷奈酸锶等药物过敏;其他继发性骨质疏松症；患有严重精神疾病。

1.3 MSCs培养

将MSCs置于含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、含有95%空气和5% CO2的湿润培养箱中培养，每2 d换液1次。将汇合率达到70%的对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 成骨分化诱导

在含有10%FBS的完全DMEM培养基中加入BMP2(300 ng/mL)培养MSCs，以诱导MSCs成骨分化，每3 d更换1次培养基。诱导成骨1 d、3 d、7 d后用茜素红染色检查基质矿化或钙沉积，通过倒置显微镜观察细胞，并用Western blot检测成骨分化标志物ALP、OPN、Runx2的表达。

1.5 细胞转染

从miRBase(http://www.mirbase.org/)获得成熟的miR-27b-3p序列。当细胞汇合率达到70%时，加入BMP2(300 ng/mL)并联合转染10 nmol/L的miR-27b-3p mimic或10 nmol/L的miR-27b-3p inhibitor，并于37 ℃下孵育24 h。

1.6 茜素红染色

MSCs细胞培养14 d后矿化形成不透明的钙化结节。细胞样品用PBS洗涤1～2次，95%乙醇固定10 min，再用PBS洗涤1～2次，用0.1%茜素红溶液染色10 min。最后用PBS冲洗，倒置光学显微镜下观察细胞中的钙结节。

1.7 双荧光素酶报告基因检测

使用TargetScan数据库版本7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-27b-3p的靶基因。设计野生型(WT)和突变型(MUT)HIF1AN 3’-UTR荧光素酶报告载体,使用LipofectamineTM2000将miR-27b-3p mimic或NC mimic与构建的WT或MUT荧光素酶报告载体共转染到MSCs细胞中；24 h后使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒评估荧光素酶活性。

1.8 定量PCR

诱导MSCs成骨1 d、3 d、7 d后，根据说明书，使用TRIzol试剂分离总RNA。然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)进行定量PCR。miR-27b-3p的序列是5’-UAUGGCUUUCUUUUCCUGUGUG-3’。所用引物为：miR-27b-3p，正向5’-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3’，反向5’-AAAGGTTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3’；HIF1AN，正向5’-GTACTGGTGGCATCACATAGAG-3’，反向5’-CTGATGGGCTTTGAGAGGATATT-3’；GAPDH，正向5’-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3’，反向5’-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3’；U6，正向5’-TTGACTCCACAAAAGGGAAGAAG-3’，反向5’-TCCAGAGGTCTGTTGAATCCG-3’。GAPDH或U6用作内部对照。HIF1AN的表达采用2-△△Ct法进行分析。

1.9 CSCI-OP大鼠模型

60只SPF级成年雄性SD大鼠，鼠龄7周，体质量(225±11)g，在正常明/暗(12 h/12 h)循环的温控室中饲养，室温(23±2)℃，自由进食和饮水。将60只SD大鼠随机分为Control组、OP组、NC mimic+OP组、miR-27b-3p mimic+OP组、NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP组、HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组，每组10只。其中，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组大鼠使用戊巴比妥钠(2%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g体质量，腹腔注射)全身麻醉，经尾静脉注射HIF1AN-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)后行C5～C7椎板切除，以锐刀横切下暴露该颈段脊髓后止血缝合，每日辅助排尿排便2～3次，每隔3 d尾静脉同时注射HIF1AN-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)。NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP组大鼠除尾静脉注射NC-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作与HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组一致。miR-27b-3p mimic+OP组大鼠除尾静脉只注射miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作与HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组一致。NC mimic+OP组大鼠除尾静脉只注射NC mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作与HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组一致。OP组大鼠不进行药物注射，全身麻醉后行C5～C7椎板切除，其余操作与NC mimic+OP组一致。Control组大鼠使用戊巴比妥钠(2%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g体质量，腹腔注射)全身麻醉后仅切开C5～C7椎板对应的皮肤，随后止血缝合。每组大鼠于28 d后行micro-CT分析，随后进行安乐死并收集股骨组织。所有动物实验程序均经我院伦理委员会批准(2020-031602DW)。

1.10 Western blot分析

收集各组MSCs或研磨后的大鼠股骨组织匀浆，在冰上于RIPA裂解缓冲液中裂解。BCA试剂盒测定蛋白的浓度。使用SDS-PAGE分离50 μg蛋白，随后转移蛋白到PVDF膜上。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭，并与抗ALP(1∶600)、抗HIF1AN(1∶800)、抗OPN(1∶500)、抗Runx2(1∶400)的一抗在4 ℃下孵育过夜。用含0.1%Tween20的PBS洗膜3次，每次10 min，并与HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗(1∶2 000)在室温下孵育2 h。随后用增强的化学发光试剂显色，并使用ImageJ软件进行分析。

1.11 micro-CT分析

使用Inveon微正电子发射断层扫描(PET)/CT仪器(德国西门子)进行骨扫描。用微型CT从股骨头到股骨髁扫描股骨和股骨头结构。使用Inveon分析工作站软件分析并获得骨体积分数(BV/TV)。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 CSCI-OP患者中miR-27b-3p的表达下调

与对照组比较，CSCI-OP组外周血中miR-27b-3p的表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

*：与对照组比较，P<0.05

2.2 miR-27b-3p参与MSCs的成骨分化

采用定量PCR检测成骨相关基因的mRNA表达，结果显示，随着成骨诱导时间的延长，ALP、Runx2和OPN的mRNA表达逐渐升高(P<0.05)，miR-27b-3p表达逐渐上调(P<0.05)，见图2a。成骨诱导7 d后，与NC mimic组相比，转染miR-27b-3p mimic的MSCs中miR-27b-3p表达及ALP、Runx2和OPN mRNA水平显著增加(P<0.05)；转染miR-27b-3p inhibitor则得到相反的结果(P<0.05)，见图2b、c。Western blot进一步证实了miR-27b-3p对ALP、Runx2和OPN蛋白表达的调控作用(P<0.05)，见图2d。MSCs过表达miR-27b-3p后，钙化结节数量增加(P<0.05)，说明矿化能力增强；MSCs抑制miR-27b-3p后，钙化结节数量减少(P<0.05)，说明矿化能力下降，见图2e。

a：定量PCR检测BMP2诱导MSCs后ALP、Runx2、OPN mRNA水平和miR-27a-3p表达；b、c：定量PCR检测BMP2处理MSCs的条件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor对miR-27a-3p和ALP、Runx2、OPN mRNA水平的影响；d：Western blot检测BMP2处理MSCs的条件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor对ALP、Runx2、OPN蛋白表达的影响；e：茜素红染色检测BMP2处理MSCs的条件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor对钙化结节的影响 *：与1 d相比，P<0.05；△：与NC inhibitor组相比，P<0.05；#：与NC mimic组相比，P<0.05图2 miR-27b-3p对BMP2诱导MSCs成骨分化的影响

2.3 HIF1AN是miR-27b-3p在MSCs中的靶基因

构建野生型HIF1AN(WT-HIF1AN-3’UTR)和突变型HIF1AN(MUT-HIF1AN-3’UTR)，双荧光素酶报告基因检测显示，HIF1AN与miR-27b-3p具有多个结合位点(图3a)。miR-27b-3p mimic和WT-HIF1AN-3’UTR共转染后MSCs的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而miR-27b-3p mimic和MUT-HIF1AN-3’UTR共转染后，荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)，见图3b。随后发现，HIF1AN的mRNA和蛋白水平均受到miR-27b-3p的负调控(P<0.05)，见图3c、d。

a：HIF1AN和miR-27b-3p序列的结合图；b:双荧光素酶报告基因检测HIF1AN和miR-27b-3p直接结合；c：定量PCR检测HIF1AN mRNA的表达；d：Western blot检测HIF1AN蛋白的表达 *：与MUT-HIF1AN-3’UTR相比，P<0.05；△：与NC inhibitor组相比，P<0.05；#：与NC mimic组相比，P<0.05图3 MSCs中HIF1AN是miR-27b-3p的靶基因

2.4 miR-27b-3p通过HIF1AN调控MSCs的成骨分化

为进一步探究miR-27b-3p和HIF1AN在调节MSCs成骨过程中的作用，本研究使用HIF1AN-OE进行挽救实验。结果显示，与NC-OE+miR-27b-3p mimic组比较，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic组中HIF1AN的蛋白表达上调(P<0.05)，但miR-27b-3p的表达变化无统计学意义(P>0.05)，见图4a～c。与NC-OE+miR-27b-3p mimic组比较，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic组中ALP、Runx2和OPN蛋白水平降低(均P<0.05)，见图4b、d。与miR-27b-3p mimic组比较，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic组的钙化结节数量显著减少(P<0.05)，见图4e、f。

a：定量PCR检测HIF1AN过表达联合miR-27b-3p mimic对miR-27a-3p表达的影响；b～d：Western blot检测HIF1AN过表达联合miR-27b-3p mimic对MSCs中HIF1AN和ALP、Runx2、OPN表达水平的影响；e、f：茜素红染色检测HIF1AN过表达联合miR-27b-3p mimic对MSCs中钙化结节的影响 *：与miR-27b-3p mimic组相比，P<0.05；#：与NC-OE+miR-27b-3p mimic组相比，P<0.05图4 miR-27b-3p通过HIF1AN调控MSCs的成骨分化

2.5 miR-27b-3p通过HIF1AN调控CSCI-OP大鼠的成骨分化

与Control组比较，OP组大鼠股骨组织中ALP、Runx2和OPN蛋白表达降低，且BV/TV明显降低，而HIF1AN上调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与NC mimic+OP组比较，miR-27b-3p mimic+OP组中ALP、Runx2和OPN蛋白表达明显增加，且BV/TV明显增加，而HIF1AN明显下调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP组比较，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP组中ALP、Runx2和OPN蛋白表达降低，且BV/TV明显降低，而HIF1AN蛋白明显上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

a～c：Western blot检测HIF1AN过表达联合miR-27b-3p mimic对大鼠股骨组织中HIF1AN和ALP、Runx2、OPN蛋白表达的影响；d：micro-CT分析HIF1AN过表达联合miR-27b-3p mimic对股骨的骨体积分数的影响 *：与Control组相比，P<0.05；#：与NC mimic+OP组相比，P<0.05；&：与NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP组相比，P<0.05图5 miR-27b-3p通过HIF1AN调控CSCI-OP大鼠的骨生成

3 讨论

本研究结果显示，miR-27b-3p通过与HIF1AN mRNA的3’-UTR位点结合，阻碍HIF1AN表达，从而促进MSCs的成骨细胞分化，表明miR-27b-3p在成骨过程中具有重要作用。大量研究表明，miRNA可以作为成骨细胞分化的关键调节剂。miR-141和miR-200a可通过靶向MSCs中的Dlx5参与成骨分化[7]；miR-378可以通过靶向BMP2促进成骨细胞分化[8]；此外，miR-764-5p可通过抑制CHIP/STUB1表达促进成骨细胞分化[9]。miR-27b是一种与成骨相关的miRNA，其表达水平在大鼠脂肪干细胞成骨过程中下调[10-11]。本研究发现，与对照组相比，CSCI-OP组患者外周血中miR-27b-3p的表达下调，而在MSCs受BMP2诱导后miR-27b-3p表达上调；miR-27b-3p过表达显著增加了ALP的活性和细胞外基质钙沉积，而miR-27b-3p敲低则抑制了上述过程。这些发现与先前研究结果一致[6]。

越来越多的证据支持Runx2作为关键的成骨细胞谱系决定转录因子参与指导成骨细胞分化这一观点[12-13]。Runx2是成骨中的主要基因，其能够诱导OPN和骨钙素等骨相关标志物的表达。本研究中，miR-27b-3p过表达上调了Runx2、OPN、ALP的表达，miR-27b-3p敲低则下调了上述蛋白的表达，表明miR-27b-3p可以促进成骨分化，与文献结果一致[6]。

据报道，HIF-1α信号通路的激活可上调MSCs中的成骨分化相关基因的表达[14]。研究还表明，增加HIF-1α的表达可以促进骨髓干细胞的成骨细胞分化[15]。HIF1AN被认为是一种可以与HIF-1α相互作用的重要抑制剂。大量证据表明，HIF1AN在多种组织的分化中起着关键作用。例如，HIF1AN受miR-455的靶向调控，从而调节棕色脂肪细胞分化[16]；HIF1AN还受到miR-31的靶向调控，可促进表皮和角膜上皮中的促分化表型增加[17-18]。研究表明，miR-27b-3p能影响HIF1AN的蛋白水平，其可与HIF1AN3’-UTR结合并促进视网膜血管的生成[19]。然而，目前尚未见关于miR-27b-3p通过靶向HIF1AN调节成骨分化的报道。本研究发现，在MSCs中HIF1AN是miR-27b-3p的直接靶标，HIF1AN的过表达降低了MSCs中的ALP、OPN和Runx2的表达以及钙沉积，还逆转了miR-27b-3p mimic对成骨分化的正向影响。另外，我们在颈脊髓损伤后骨质疏松症动物模型中观察到miR-27b-3p可以通过抑制HIF1AN促进颈脊髓损伤后骨质疏松症大鼠的成骨分化，颈脊髓损伤后骨质疏松症大鼠的股骨组织中ALP、Runx2和OPN下调，且BV/TV明显降低，而HIF1AN表达上调。miR-27b-3p mimic则可以明显促进ALP、Runx2和OPN蛋白的表达和BV/TV的增加，并明显抑制HIF1AN的表达；然而过表达HIF1AN后上述指标变化都被逆转。表明miR-27b-3p可通过靶向HIF1AN促进SCI-OP大鼠MSCs的成骨分化。

综上所述，本研究的体外实验证实，miR-27b-3p通过靶向抑制HIF1AN促进MSCs的成骨分化；而体内实验证实，miR-27b-3p可通过靶向抑制HIF1AN促进骨生成，进而改善CSCI-OP大鼠的骨质疏松症。这为miRNA在成骨分化中的作用和调控机制提供了新的见解，提示靶向miR-27b-3p的治疗方法可用于增强新骨形成和治疗颈脊髓损伤诱导的骨丢失。