BRAFV600E 和TERT启动子突变在甲状腺乳头状癌中的作用研究

陈勇

（蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科甲乳三病区，蚌埠 233004）

甲状腺癌是临床上较为常见的恶性肿瘤[1]，甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）是其中最为常见的一种亚型，占比高达4/5[2]。经过临床治疗，多数甲状腺乳头状癌患者可以取得较好的疗效，但仍有十分之一的患者会出现复发[3]。越来越多的研究表明，BRAF基因 在多个癌症中均存在广泛的突变[4-5]。不同的BRAF突变具有不同的临床和治疗意义，尤其是V600E和非V600E突变之间的区别[6]。近年来随着基因测序技术的发展，BRAF及TERT启动子突变在甲状腺癌发病过程中的作用越来越受到重视。本研究通过对PTC肿瘤细胞进行BRAFV600E以及TERT的检测，探讨了突变体在PTC中的作用功能。

1 资料和方法

1.1 研究对象 回顾性分析2018年8月至2021年8月在我院就诊的甲状腺乳头状癌（PTC）患者68例，平均年龄（40.62±11.92）岁，其中男性13人，女性55人，多灶肿瘤4例，单发64例。侵犯包膜33例，未侵犯包膜35例。无淋巴结转移N0期36例，有淋巴结转移pN1期32例。根据BRAFV600E启动子突变情况分为突变组及无突变组，无突变组有23例，平均年龄（40.05±12.81）岁。突变组45例，平均年龄（40.12±13.18）。

纳入的研究对象：确诊为甲状腺乳头状癌患者，无其他恶性肿瘤，无精神疾病，术后病理切片确诊为甲状腺乳头状癌。排除标准：病史病例不完全者；既往有严重心肝肾等重要脏器功能障碍者；既往有服用甲状腺素药史者。

所有患者对研究内容知情，且均签署知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法 将PTC肿瘤样本进行DNA的提取。采用试剂盒进行DNA的提取，所有操作严格按照操作指南，提取完毕后进行浓度测定，放置于4℃保存备用。

采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测BRAFV600E及TERT启动子突变的情况。登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，查找到BRAF和TERT基因的序列，由上海生物公司进行引物设计并合成，设计BRAF基因上游引物序列5'-CATCTCACCTCATCCTAACACA-3'，下游引物序列5'-GCCTCAATTCTTACCATCCACAA-3'。设置PCR反应体系（基因组DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；2X Taq PCR MasterMix：25 μL；ddH2O：20 μL），反应条件（①94℃，3 min；②94℃，30 sec；③55℃，30 sec④72℃，1 min；⑤72℃，5 min；②-④*30）。

同理，设计TERT基因上游引物序列5'-GGGCTCCCAGTGGATTC-3'，下游引物序列5'-CC AC TACCGCGAGGTG-3'，设置PCR反应体系（基因组DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；dNTP mix：1 μL；GC-RICH resolution solution:10 μL；GCRICH Reaction buffer:10 μL；GC-RICH System enzyme mix:1 μL；ddH2O：23 μL），PCR扩 增 结 束后，进行琼脂糖凝胶电泳，通过比对条带大小确定是否为目标产物。确认无误后送至金唯智生物公司进行测序检测，比对测序结果以及正常序列，探讨是否存在突变。

1.3 观察指标 分析比较BRAFV600E和TERT启动子与甲状腺乳头状癌的相关联系。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0进行数据处理分析，年龄、肿瘤大小等计量资料采用独立样本t检验。计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRAFV600E启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系BRAFV600E启动子突变率为66.18%，突变组与无突变组在年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 BRAFV600E启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系

2.2 TERT启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系TERT启动子突变率为11.76%，突变组与无突变组在年龄及送检淋巴结数目之间差异无统计学意义（P＞0.05），在肿瘤大小上具有差异性，突变组的肿瘤明显大于无突变组（P＜0.05），见表2。

表2 TERT启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系

2.3 BRAFV600E+TERT启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系BRAFV600E启动子联合TERT突变的发生率为7.35%，突变组与无突变组在年龄及送检淋巴结数目之间并无明显差异性（P＞0.05），在肿瘤大小上具有差异性，突变组的肿瘤明显大于无突变组（P＜0.05），见表3。

表3 BRAFV600E+TERT启动子突变与年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间的关系

2.4 BRAFV600E及TERT启动子突变与临床特征的关系 对BRAFV600E及TERT启动子突变与临床特征之间进行分析，发现BRAFV600E是否突变与中央区转移之间具有差异性，其突变状态与肿瘤组织有无中央区转移存在差异（P＜0.05）；TERT的突变状态与肿瘤组织有无腺外浸润存在差异（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT启动子的联合突变状态与腺外浸润、包膜侵犯及淋巴结转移有无之间存在差异（P＜0.05）。见表4。

表4 BRAFV600E及TERT启动子突变与临床特征的关系

3 讨论

根据2021年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，甲状腺癌在全球造成586000例病例，在2020年的发病率中排名第9，女性的全球发病率为每100000人中10.1人，是男性的3倍[7-8]。相比于高的发病率,这种疾病的死亡率要低得多，女性为每10万人0.5人，男性为0.3人每10万人，估计有44000人死亡。发病率的上升主要是由于分化型甲状腺癌(Differentiated Thyroid Cancers，DTC)和乳头状甲状腺癌(PTC)的诊断增加[9]。在过去的30年中，滤泡性(FTC)、间变性(ATC)和髓样(MTC)甲状腺癌的发病率一直保持相对稳定。但是随着医学检测手段的发展，广泛的使用成像技术、活检程序[例如，细针穿刺(FNA)]、医学监测以及居民医疗保健的改善等，促进了临床PTC的检出率[10-11]。由此产生的过度诊断总是伴随着过度治疗，根据美国预防服务工作组的说法，对无症状成人进行TC筛查相关的风险可能超过其潜在益处[12]。

DTC（包括低分化形式）的诊断工作包括术前和术后病理和分子评估。≤1 cm的结节不需要进行术前FNA细胞学检查,应根据病变大小和超声外观来决定是否抽吸较大的结节[13]。细胞学结果被分为与不同恶性肿瘤风险相关的诊断类别。大多数恶性甲状腺肿瘤可以通过细胞学识别。值得注意的例外是FTC和新定义的“具有乳头状核特征的非侵入性甲状腺滤泡肿瘤”(NIFTP)，它们通常在各种甲状腺细胞学报告方案中被归类为不确定的[14-15]。除非有丝分裂活动明显增加和/或坏死，否则基于FNA对低分化癌的诊断也具有挑战性[16]。通过评估恶性肿瘤标志物（包括通常在肿瘤中过度表达的蛋白质，例如HBME1或galectin-3）和与恶性肿瘤特别相关的分子改变（例如BRAF突变、RET融合、其他新基因改变），可以促进FNA诊断[17]。另外有研究表明，血浆glactin-3、sIL-2R水平联合检测对于诊断甲状腺癌较单独应用具有更高的临床价值,并且与甲状腺癌分期、淋巴结转移有关[18]。

甲状腺乳头状癌(PTC)是一种上皮恶性肿瘤，它是最常见的甲状腺肿瘤，PTC的一个关键特征是它能够侵入邻近的结构，如淋巴管[19]。BRAF突变是PTC中最常见的遗传改变，约占PTC的29%~69%[20]。高 细 胞 变 异 （PTC的 侵 袭 性 变 异）中BRAFV600E突变的高频率表明BRAFV600E突变可能与PTC侵袭性表型相关，研究表明，BRAFV600E通过诱导基因组不稳定性促进了PTC的发生发展[21]。TERT是端粒酶的催化亚基，其启动子区最常见的两个突变分别是C228T和C250T，这两个突变能够增强启动子的转录活性，促进甲状腺癌的发生[22]。最近，有研究显示TERT启动子的突变和BRAF突变之间存在一定的相关性[23]。自TERT突变首次报道以来，它与BRAF突变被广泛认为与甲状腺乳头状癌的致病机理有关[24]。

在本研究中，BRAFV600E启动子突变率为66.18%，突变组与无突变组在年龄、肿瘤大小及送检淋巴结数目之间并无明显差异（P＞0.05）。TERT启动子突变率为11.76%，突变组的肿瘤明显大于无突变组（P＜0.05）。BRAFV600E启动子联合TERT突变的发生率为7.35%，突变组的肿瘤明显大于无突变组（P＜0.05）。对BRAFV600E及TERT启动子突变与临床特征之间进行分析，发现BRAFV600E是否突变与中央区转移之间具有差异性，其突变状态与肿瘤组织有无中央区转移存在差异 （P＜0.05）；TERT的突变状态与肿瘤组织有无腺外浸润存在差异（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT启动子的联合突变状态与腺外浸润、包膜侵犯及淋巴结转移有无之间存在差异（P＜0.05）。

综上，在PTC患者中，BRAFV600E的突变率较高，与患者临床特征关联性不强，TERT的突变率较低，与患者肿瘤大小相关，对PTC患者预后评估具有指导意义，同时出现BRAFV600E及TERT启动子突变的发生率较低，且与患者的肿瘤转移、浸润存在相关性，对PTC风险评估有重要价值。BRAFV600E和TERT启动子的突变情况的检测为临床甲状腺乳头状癌的诊治提供了一定的参考价值，但是其仍有一定的局限性。