槲皮素对卵巢去势大鼠骨质疏松的影响

闵珺，程清凤，章桥，袁真

（南昌大学第二附属医院，南昌 330006）

女性在绝经期后，由于体内雌性激素的缺乏，导致免疫系统激活，炎症因子慢性持续增高，最终造成骨量的丢失，骨小梁微结构破坏。临床上治疗骨质疏松所采用的激素替代疗法，由于在宫颈癌及子宫内膜癌等方面的副作用而令人担忧。因此，寻求一种有效且副作用轻的药物是目前国际医疗界治疗绝经后骨质疏松的重要课题。

大量研究已经证实，杜仲黄酮作为杜仲叶中的有效成分，具有抗骨质疏松的疗效[1-2]。槲皮素作为杜仲黄酮类有效成分具有类雌激素作用，能够通过抑制骨质的吸收促进成骨，从而抗骨质疏松的作用[3]。本实验拟通过研究槲皮素对卵巢去势大鼠骨质疏松的影响，为临床治疗绝经后骨质疏松症提供有效的依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物来源8周龄SPF级雌性SD大鼠30只，体重（265.70±7.89）g，购自湖南斯莱克景达试验动物有限公司，合格证号：SCXK（湘）2016-2002。实验期间保持良好的通风，室温在22～26℃，保持40%～60%的相对湿度。

1.1.2 实验药品及配制 实验药品：槲皮素、羧甲基纤维素钠（CMC－Na）由Sigma公司提供，产品批号：XSD201510008。槲皮素由sigma公司提供，0.5%羧甲基纤维素钠溶剂助溶，4℃冰箱避光保存。

1.1.3 主要仪器 （1）离心机：赛默飞世尔科技公司。（2）Mirco-CT检测仪：（上海怀宇生物有限公司）对大鼠股骨进行扫描并行数据分析。（3）全自动生化分析仪：Roche Diagno’stics。（4）骨密度测量仪：GE公司。

1.2 实验方法 （1）取8周SD大鼠30只，体重（265.70±7.89）g。适应性喂养1 w后，随机分成3组，假手术组（Sham组），模型组（OVX组），槲皮素组（Quercetin+OVX组），各10只。（2）OVX组和Quercetin+OVX组：1%的戊巴比妥钠对SD大鼠进行腹腔注射麻醉后，超净台内从大鼠下腹部做纵行切口，切开腹直肌，结扎双侧输卵管，并切除双侧卵巢，随后缝合肌层及皮肤；Sham组：切除卵巢附近与卵巢质量大致相等的脂肪组织，不对卵巢做任何处理。术后自由饮水，摄食。（3）术后第3天开始，Sham组、OVX组均每天给予3 mL羧甲基纤维素钠(CMC－Na)灌胃，Quercetin+OVX组给予槲皮素溶剂按照50 mg／（kg·d）灌胃。槲皮素给药剂量根据人鼠等效剂量转换表进行换算[4-5]。（4）连续灌胃8周后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，经膀胱收集大鼠尿液，检测尿液中钙离子（U－Ca）和磷离子（U-P）的浓度水平；同时收集SD大鼠股动脉血液进行离心（3000 r／min），选取上层血清进行钙离子（S-Ca）及磷离子（S-P）浓度测定。（5）通过剪破心脏处死大鼠，分离SD大鼠一侧股骨，置于Mirco-CT线圈进行CT螺旋扫描，计算机测定骨矿物质含量（Bone Mineral Density，BMD）、骨小梁数量（Trabecula,Tb.N）、骨小梁厚度(Trabecula Thickness,Tb.Th)、相对骨体积（Bone Volume,BV/TV）、结构模型指数（Structure Model Index,SMI），取大鼠另外一侧股骨，进行骨力学性能分析，测定弹性载荷、弹性桡度、最大载荷和最大桡度。

2 结果

2.1 槲皮素对卵巢去势大鼠体重的影响 与Sham组比较，OVX组和Quercetin+OVX组的大鼠体重逐渐升高。8周后，两组大鼠体重与Sham组开始出现差异（P＜0.01），并且OVX组和Quercetin+OVX组两组大鼠之间体重增长差异不明显（P＞0.05），见图1。

图1 各组大鼠体重测定结果

2.2 槲皮素在血清和尿液中钙、磷的影响 各组间S-Ca和S-P平均浓度无明显差异（P＞0.05）。与Sham组相比，OVX组大鼠U-Ca、U-P浓度水平显著升高（P＜0.05）；Quercetin+OVX组的U-Ca、U-P浓度水平显著低于OVX组(P＜0.05)；而三组间血钙与血磷水平无统计学差异（P＞0.05）。以上结果表明，槲皮素能在不同程度上抑制去卵巢大鼠UCa、U-P的丢失。见图2。

图2 各组大鼠血钙、血磷、尿钙、尿磷测定结果

2.3 槲皮素增加卵巢去势大鼠股骨干骺端骨小梁数量和骨小梁厚度 从Micro-CT三维重建图可以看出，与Sham组比较，OVX组大鼠股骨干骺端骨小梁数量显著减少，骨小梁厚度变薄；经槲皮素干预后的大鼠股骨干骺端的骨小梁和厚度均增加，见图3。

图3 各组大鼠mirco-CT结果测定

2.4 槲皮素增加卵巢去势大鼠的BMD值和结构生物力学性能 大鼠在去除卵巢后，由于缺乏雌激素，导致骨量减少，表现为OVX组大鼠的BMD值显著低于Sham组大鼠（P＜0.01）；在给去卵巢大鼠口服槲皮素后，骨丢失减少，表现为Quercetin+OVX组 大鼠 的BMD值 高 于OVX组 大 鼠（P＜0.05）（见图4A），且与Sham组相比也存在一定的差异（P＜0.05），结果表明槲皮素可以提高BMD值，但不能逆转骨丢失。弹性桡度、最大桡度、弹性载荷作为生物力学相关指标，能够反应骨的力学性能。与Sham组相比，OVX组股骨弹性桡度、最大桡度、弹性载荷及最大载荷均显著降低（P＜0.05）。经槲皮素干预后，Quercetin+OVX组以上各项指标均高于OVX组（P＜0.05），见图4B和C。

图4 B和C示 通过三点弯曲试验，观察各组大鼠股骨弹性桡度、最大桡度、弹性载荷及最大载荷值

2.5 槲皮素改善骨形态学参数 通过Micro-CT进行三维立体扫描，结果显示：与Sham组相比，OVX组 的Tb.N、Tb.Th、BV/TV均 显 著 降 低(P＜0.05)。OVX组的SMI值高于Sham组大鼠(P＜0.05)；与OVX组相比，槲皮素能显著提高Tb.N、Tb.Th、BV/TV，改善股骨微结构(P＜0.05)，见图5。

图5 各组大鼠骨相关参数测定

3 讨论

骨质疏松的治疗一直以来都是一个难题，临床上常使用雌激素补充疗法来治疗绝经后骨质疏松，但雌激素的副作用，在一定程度上限制了它的用途。有证实杜仲黄酮能够影响骨代谢，并发挥着积极的作用。槲皮素是杜仲黄酮亚类的主要单体成分，已有的研究发现其具有抗骨质疏松的作用，但其机制不明。研究者Kim YJ采用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析表明槲皮素能够诱导骨桥蛋白、骨形态发生蛋白和Runx2的表达增加，小鼠体内实验证实了槲皮素能够通过激活雌激素受体依赖机制增强细胞成骨分化，从而增加骨密度，改善骨微结构[6-8]。

本研究选取8周龄的SD大鼠，去势后结果显示假手术组（Sham组）的骨小梁厚度、骨小梁数量等指标均显著高于OVX组，表明造模成功。骨的构成主要是分为骨矿物质与骨基质两部分。在骨微环境中，存在着破骨与成骨的一个动态平衡，绝经后的大鼠，这个平衡系统被打破，破骨占据优势时，骨的吸收增加[9]。通过检测血液和尿液中的钙离子、磷离子水平，可以间接反映骨的代谢情况。研究显示，卵巢去势大鼠与正常健康大鼠相比，血清钙、磷离子浓度水平之间无明显差异性，尿液中钙离子与磷离子的浓度显著升高，说明尿钙与尿磷的排泄，可能与骨密度的下降有一定相关性[10]。而本研究也发现，OVX组大鼠尿钙和磷的水平明显较Sham组升高，槲皮素能够显著降低OVX大鼠尿钙和磷的水平，其结果与以往研究一致。

我们通过观察槲皮素治疗卵巢去势大鼠骨质疏松的疗效，发现槲皮素能够在不影响大鼠体重的前提下增加去卵巢大鼠的骨小梁数量（Tb.N）及骨小梁厚度(Tb.Th)，增加骨矿物质含量(BMD)，即槲皮素能够改善骨的微结构，提高骨的质量，我们的研究结果与以往的研究一致[11]。实验使用Micro-CT对大鼠股骨的干骺端进行扫描，对股骨结构的骨形态学参数进行分析。BV/TV、TB.N、Tb.Th作为骨结构的正向指标，实验结果提示去除卵巢的大鼠，将会导致骨小梁结构生长不良，BV/TV、TB.N、Tb.Th均下降，骨小梁出现断裂甚至消失。而SMI是骨形态参数的一个负性指标，理想状态下，标准杆状骨和板状骨的SMI值分别为3和0。去除卵巢的大鼠较正常大鼠的SMI值高。实验证实槲皮素可降低SMI值，改善骨的微结构环境，减少骨质丢失，尽管如此，但却不能逆转骨的丢失。这也提示我们，尽早开展绝经后的骨质疏松治疗可以有效的降低骨丢失，女性绝经期间骨质疏松的预防尤为重要。

此外本实验通过测定骨力学性能分析，其结果显示槲皮素能够提高骨的载荷和桡度，说明槲皮素能够改善骨的功能。因此槲皮素能够从结构和功能两方面治疗绝经后骨质疏松。

有研究表明增加血钙的吸收，减少尿钙的排泄，对防止骨密度的降低能够起到一定的帮助作用[12]，这与研究结果中槲皮素干预组OVX大鼠尿钙、尿磷减低的结果一致。以上实验数据表明槲皮素能够增加骨矿物质含量，减少钙磷丢失，来保持骨的形成与吸收平衡不被打破。

已有综述报道，槲皮素具有类雌激素作用，能够通过抑制骨质的吸收达到促进成骨的作用[13]。有研究表明[14]，在刺激骨祖细胞向成熟的成骨细胞分化过程中，雌激素扮演着重要角色。去除卵巢后的大鼠由于雌激素的缺乏能显著增加大鼠体重，而本研究结果显示Quercetin+OVX组与OVX组大鼠体重无明显差异，表明槲皮素不能抑制雌激素缺乏所致的大鼠体重增加，但另一方面也证实该药物在体重方面无不良影响。目前应用雌激素治疗绝经后骨质疏松在宫颈癌及子宫内膜癌等方面的副作用令人担忧，上述研究结果使我们减轻了该成分在子宫相关并发症方面的顾虑[15-16]，为今后运用槲皮素等杜仲黄酮类治疗绝经后骨质疏松以及其他疾病提供理论疾病。

综上所述，槲皮素作为杜仲黄酮类单体对去卵巢大鼠具有抗骨质疏松的作用。槲皮素是通过改善骨代谢，增加BMD，提高骨形态学参数达到抗骨质疏松的作用。在此部分研究中，我们已成功分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞，后续的实验中我们将从细胞层面研究其具体抗骨质疏松机制。