金粉蕨素抗肿瘤和抗血管内皮细胞氧化损伤的研究

吴广,沈倩,许时丽,符平,李荣（南华大学附属第二医院,湖南 衡阳 421001）

恶性肿瘤的发生发展过程中，抗氧化防御系统通过产生多种促氧化酶如NAPDH酶、环氧化酶、黄嘌呤脱氢酶等发挥重要作用[1]。近年来，黄酮类化合物的抗癌和抗氧化活性是国内外研究的一大热点，其具有抑制癌细胞生长的特性，被认为是预防癌症和抗癌症临床的理想化合物[2-4]。

金粉蕨含有黄酮类化合物，金粉蕨植物中提取分离得到的一种二氢黄酮苷（flavanone glycoside）-金粉蕨素（onychin），已发现其对人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞和人卵巢癌细胞等都表现出较好的增殖抑制活性[4-6]。本研究旨在继续扩展其在抗癌和抗氧化等方面的药理活性的研究。

1 材料和方法

1.1 金粉蕨素溶液的配置 以二甲基亚砜（DMSO）溶解金粉蕨素粉剂使储存液的浓度为200mg/mL，使用0.22µm孔径微孔滤膜过滤后，4℃避光保存，一个月内使用。使用无血清培养基稀释至20μg/mL，并使DMSO的终浓度低于0.1%，以最高浓度组DMSO含量作为阴性对照组，12µg/mL的5-氟尿嘧啶（5-FU）作为阳性对照组。

1.2 细胞培养 MGC-803细胞、HeLa细胞和HepG2-A16细胞培养于1640培养基中，添加10%的胎牛血清、100u/ml青霉素和100µg/ml链霉素，行细胞培养。

1.3 MTT法 选取处于对数生长期的肿瘤细胞MGC-803、Hela、HepG2-A16，使用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，使用含血清1640培养基重悬为密度为2.5×104个/ml的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔加入200µl单细胞悬液。细胞贴壁过夜后加入不同浓度的含金粉蕨素培养基：0、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0µg/mL；以12µg/mL的5-FU作为阳性对照组，0.01%DMSO组作为阴性对照组。在酶标仪490nm处检测OD值，计算各组的相对抑制率（IR）。

1.4 克隆形成实验 取上述实验平行处理的肿瘤细胞，在经过不同浓度的金粉蕨素处理48h后，分别用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，离心计数，稀释密度500个/ml，在6孔板中每孔加入1ml单细胞悬液，轻轻晃匀，在37℃的环境下培养2-3周，直至出现肉眼可见克隆集落。终止培养，PBS漂洗两次，加入4%多聚甲醛固定细胞30min，使用1%的结晶紫染色20min，经缓慢的流水洗去多余的染色液，室温滤干。在显微镜（低倍镜）下计数大于20个的克隆集落数，计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.5 离体兔胸主动脉血管内皮损伤实验 利用戊巴比妥钠（30.0mg/kg）耳缘静脉注射麻醉新西兰兔（南华大学实验动物部）后，将其颈动脉放血致死。ACh诱导血管内皮舒张功能以PE收缩的舒张百分率表示。观察ACh诱导的舒张百分比。

1.6 统计学分析 实验数据通过SPSS19.0统计分析，数据以平均值±方差表示，组内数据经方差检验，组间数据采用t检验，P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 金粉蕨素抑制肿瘤细胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖 由图1可见，金粉蕨素可以显著抑制肿瘤细胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖活性，1.25μg/mL的金粉蕨素的活性抑制率分别为24%、19%、31%，相对DMSO组具有统计学意义（P＜0.05）。而不同的肿瘤细胞对金粉蕨素的敏感度还是具有显著差异的，由图2可见，MGC-803和HepG2-A16细胞相对HeLa细胞对金粉蕨素具有更强的敏感度。

图1 MTT法检测金粉蕨素对常见肿瘤细胞活性的影响

图2 不同肿瘤细胞的耐药性

2.2 金粉蕨素抑制肿瘤细胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力 由图3可见，金粉蕨素可以显著抑制肿瘤细胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力，2.5μg/mL的金粉蕨素的克隆形成能力分别为74.6%、47%、37%，相对DMSO组具有统计学意义（P＜0.01）。

图3 金粉蕨素对常见肿瘤细胞克隆形成能力的影响

2.3 金粉蕨素对LPC损伤新西兰兔离体胸主动脉血管内皮舒张功能的影响 由图4可见，5.0μg/mL-50.0μg/mL的金粉蕨素对4.0μg/mL的LPC损伤的兔血管内皮舒张功能没有明显影响（P＞0.05）；而在125.0μg/mL的金粉蕨素作用下，被LPC损伤的兔血管内皮舒张功能与对照组有明显差异（P＜0.001）。

图4 金粉蕨素对新西兰兔胸主动脉舒张功能的影响。注：与LPC组比较，#P＜0.05；与LPC组比较，*P＞0.05

3 讨论

目前针对恶性肿瘤的治疗大多数采用手术、放化疗相结合的措施，治疗效果不理想[7-8]。因此，寻找高效低毒的抗癌先导化合物是当务之急，也是肿瘤研发的首要任务之一。本研究发现金粉蕨素对MGC-803、HeLa和HepG2-A16细胞增殖和克隆形成能力具有抑制作用，并且呈浓度依赖性。与5-FU比较，金粉蕨素可作为先导化合物，获得一系列衍生物，形成活性更强的抗癌化合物。

金粉蕨素作为一种新型二氢黄酮苷单体化合物[9]，能够终止自由基的连锁反应，从而发挥抗氧化损伤作用[10-11]。本研究用离体兔胸主动脉血管内皮损伤实验，发现金粉蕨素对LPC损伤的新西兰兔胸主动脉血管内皮舒张功能的作用强度与维生素E近似，保护ACh诱导的血管内皮依赖性舒张。目前的研究还仅限于体外实验，因此金粉蕨素体内对心血管保护作用及心血管疾病防治的功能有待进一步研究。

综上所述，金粉蕨素抗肿瘤作用已经得到初步证实，本实验研究发现其可以显著降低MGC-803、HeLa和HepG2-A16细胞增殖和克隆形成能力，表明了金粉蕨素单体的初步药理方向，为传统中药开发肿瘤有效药物提供了科学依据。