子痫前期相关lncRNA SNHG12对滋养细胞侵袭功能的影响

栾丽霞，杨 洋，陈国平，惠淑宁，王稳莹*

(西安医学院第一附属医院妇产科,西安 710077；西安市人民医院，西安市第四医院生殖医学中心；*通讯作者,E-mail:563694923@qq.com)

子痫前期(pre-eclampsia，PE)是妊娠期所特有的全身多系统异常的疾病，全世界发病率高达5%～8%[1]。但该病确切机制未明，众多学者认为胎盘是引发PE的根源所在[2,3]，其中滋养细胞浸润、侵袭功能异常而导致胎盘形成异常，为子痫前期发生的主要机制学说[4,5]。因此，研究影响滋养细胞功能的相关因素，对于进一步揭示子痫前期发病机制有一定的意义。

近年来有研究发现，部分长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)参与了PE的发病过程，并可以调控滋养细胞的侵袭功能[6]。越来越多证据表明，lncRNA不仅在细胞凋亡、侵袭以及肿瘤转移发挥作用[7]，还可以调控同为非编码NRA(non-coding RNA, ncRNA)属性的miRNA，间接影响下游靶基因从而发挥相应的功能[8,9]。lncRNA-小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12,SNHG12)在肾透明细胞癌中可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)miR-30a-3p,抑制肾癌细胞的迁移功能[10]。课题组前期研究发现miR-30a-3p在子痫前期呈特异性高表达[11]，其靶基因SLUG(又称Snail 2，锌指蛋白2)在PE胎盘中病理性低表达，并可影响滋养细胞的侵袭功能[12]。

lncRNA-SNHG12是否与PE发病相关，及其能否作为miR-30a-3p的上游因子发挥“ceRNA样”作用，进而影响下游靶基因SLUG表达而改变滋养细胞侵袭功能，从而参与PE的发病，值得探究。本研究分析了SNHG12在重度子痫前期患者(sPE)胎盘组织中的表达及其可通过调控miR-30a-3p以及SLUG的表达影响JEG-3细胞侵袭功能。

1 材料与方法

1.1 临床资料

重度子痫前期孕妇(sPE组)和同期健康孕妇(正常组)胎盘组织均收集于2021年3月至2021年10月西安医学院第一附属医院妇产科收治的首次接受剖宫产分娩的患者。根据既往文献和预实验结果，PE组胎盘组织中lncRNA-SNHG12的相对表达量约为0.5，正常组约为0.8，α=0.05，β=0.2，根据两均数比较的样本量计算公式得出每组需要16例，考虑标本污染等因素，每组纳入20例。其中，sPE组的纳入依据第9版《妇产科学》中的诊断标准[13]。排除标准:两组均需排除合并糖尿病、慢性高血压、心脏病、慢性肾炎以及自身免疫性疾病、血栓性疾病、精神疾病、感染性疾病的患者。本研究经西安医学院第一附属医院伦理委员会批准，所有纳入研究对象均签署知情同意书。

胎盘娩出后，选取胎盘母面剪取约1 cm3胎盘组织，无菌PBS冲洗组织后立即放入液氮中，-80 ℃保存待用。

1.2 主要试剂及细胞株

JEG-3细胞购自中科院细胞库；PCR引物由广州瑞博生物技术有限公司合成；反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)；空质粒(pcDNA3.1)和SNHG12(pcDNA3.1-SNHG12)过表达质粒、siRNA(SNHG12抑制序列)购自上海吉玛制药技术有限公司；荧光定量试剂盒购自(天根生化科技(北京)有限公司)；lipofectamineTM2000购自美国Beckman；鼠抗人SLUG、鼠抗人GAPDH一抗、二抗兔抗鼠购自美国Abcam。

1.3 细胞培养及转染

JEG-3常规复苏，接种于含10%FBS、1%链霉素-青霉素的RPMI-1640完全培养基中，放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中；取对数生长期JEG-3细胞，分为：对照组(NC)组、过表达(OE-SNHG12)组、抑制(si-SNHG12)组，按照脂质体说明书步骤分别转染空质粒(pcDNA3.1)、SNHG12(pcDNA3.1-SNHG12)过表达质粒、siRNA(SNHG12抑制序列)序列，转染6 h后换液1次，培养24 h后进行后续实验。

1.4 qRT-PCR检测胎盘组织中lncRNA-SNHG12及转染后JEG-3细胞中lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、SLUG mRNA表达

按TRIzol试剂盒进行两组冻存胎盘组织及各转染组细胞中的RNA，随后测定RNA质量，反转录成cDNA -20 ℃留存。根据PrimerBank公布的基因序列设计合成lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、SLUG及内参β-actin、U6的引物序列，具体序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Target gene primer sequences for qRT-PCR

应用比较分析Ct值法，使用2-△△Ct法计算各组中目的基因mRNA的相对表达量。试验设定3个复孔，重复3次。

1.5 Transwell侵袭试验检测各转染组JEG-3细胞侵袭功能

将基质胶稀释后涂于Transwell(8 mm)的腔室顶层，将转染后的各组细胞接种于上室(不含FBS的RPMI-1640液)，小室下层加入含45 μl含10%胎牛血清的培养液中。培养24 h后，使用70%乙醇固定侵袭入小室的细胞，而后0.1%结晶紫染色。随机对染色的细胞取4个视野进行拍照并在显微镜下计数,试验重复3次。

1.6 Western blot检测各转染组SLUG蛋白的表达

转染后48 h按细胞裂解液说明书提取各转染组细胞总蛋白，二辛可宁酸方法测定蛋白含量。取等量蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，而后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h(室温)。加入SLUG(1 ∶2 500)或GAPDH鼠抗人一抗(1 ∶2 500)，4 ℃过夜。PBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(1 ∶2 000)抗室温放置2 h，PBST洗膜3次。化学发光反应后发光，X片曝光、显影、定影。目的蛋白的表达量以SLUG/内参GAPDH比值表示。实验重复3次。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 胎盘组织中lncRNA-SNHG12的表达情况

正常孕妇及sPE患者在年龄、孕周、体质量指数方面均无统计学意义(P>0.05，见表2)；根据既往文献，血压、尿蛋白也是影响PE严重程度及可能影响SNHG12表达的指标。因所有PE患者均有尿蛋白及血压升高的情况，而健康患者均没有，故这两项指标仅描述，不比较。sPE组的lncRNA-SNHG12相对表达量低于正常组(0.45±0.06vs0.88±0.12，P<0.001，见图1)。

表2 两组患者基本资料Table 2 Basic information of the objects in two groups

与正常组比较，***P<0.001图1 lncRNA-SNHG12在正常与sPE患者胎盘组织中的表达Figure 1 Comparison of lncRNA-SNHG12 in placental tissue between normal controls and sPE patients

2.2 lncRNA-SNHG12对JEG-3细胞中miR-30a-3p和SLUG的影响

与对照组相比，过表达组中lncRNA-SNHG12表达水平显著升高(P=0.001)，抑制组中lncRNA-SNHG12表达水平显著降低(P=0.005，见图2)。

与对照组比较，***P<0.01图2 JEG-3细胞转染后lncRNA-SNHG12的表达水平Figure 2 Expression levels of lncRNA-SNHG12 in JEG-3 cells after different transfection

与对照组相比，过表达组中miR-30a-3p表达降低(P<0.001)；抑制组miR-30a-3p表达升高(P<0.001，见图3)。与对照组相比，过表达组中的SLUG在mRNA水平及蛋白水平均升高(P<0.001)；抑制组中的SLUG在mRNA水平及蛋白水平均降低(P≤0.001，见图4)。

与对照组比较，***P<0.001图3 JEG-3细胞不同转染后miR-30a-3p的相对表达水平Figure 3 Relative expression levels of miR-30a-3p in JEG-3 cells in each group

与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001图4 各转染组JEG-3细胞中SLUG mRNA及蛋白的表达水平Figure 4 Expression of SLUG mRNA and protein in JEG-3 cells in each group

2.3 lncRNA-SNHG12对JEG-3细胞浸润能力的影响

侵袭小室(Transwell)结果显示，与对照组相比，过表达组细胞侵袭能力升高(P<0.001),抑制组细胞侵袭能力降低(P=0.007，见图5)。

与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001图5 lncRNA-SNHG12对JEG-3细胞侵袭能力的影响Figure 5 Effect of lncRNA-SNHG12 on the invasion ability of JEG-3 cells

3 讨论

PE常在妊娠20周后发病，可导致母儿预后不良[14]，其病因尚未明确。目前认为滋养细胞功能异常、氧化应激、母-胎界面免疫异常[15]均参与了PE的发生发展，而胎盘是这一综合征发病的中心机制。有研究提出滋养细胞侵袭异常可能导致胎盘“浅着床”，最终诱发了PE的发生[16]。诸多研究表明，PE胎盘组织中存在差异表达的ncRNA(包含lncRNA、微小RNA等)，这些ncRNA可介导滋养细胞功能，最终参与PE发病过程[17,18]。lncRNA-SNHG12可通过调节肿瘤细胞的增殖、侵袭进而参与胶质瘤、肾癌、结肠癌等肿瘤的进展[19,20]。本研究显示，lncRNA-SNHG12在PE患者胎盘组织中较正常孕妇明显降低(P<0.05)。我们推测SNHG12可能参与了PE的发生过程，但仍需进一步探究其具体机制。

lncRNA与微小RNA(microRNA，miRNA)作为ncRNA的重要组成部分，在参与机体功能甚至肿瘤的生长中均发挥着关键的作用[21]。且lncRNA可作为microRNA“分子海绵”发挥“ceRNA”作用。已有多项研究证实，SNHG12可以作为“ceRNA”多种miRNA并调节其下游靶标的功能或表达。在胃癌中SNHG12可通过对miR-199a-5p发挥ceRNA作用，从而上调Argo2的表达[22]；在肾透明细胞癌中lncRNA-SNHG12与miRNA-30a-3p之间的负向调控关系已经证实[23]。本研究向人绒毛膜滋养细胞(JEG-3)中分别转染SNHG12过表达及抑制序列，结果显示：在JEG-3中过表达及抑制SNHG12后，miRNA-30a-3p出现负性表达(P<0.05)。与Zhou等[23]的研究具有一致性。

SLUG作为Snail转录因子家族重要成员，能够参与肿瘤的发生过程[24]。SLUG与miRNA-30a-3p在3′非翻译区(3′-UTR)内的种子序列可互补结合，两者之间具有负性调控关系。研究发现miR-30a-3p可通过靶向SLUG抑制上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)对胚胎着床产生一定影响[25]。本研究发现lncRNA-SNHG12与PE发病相关。且在人滋养细胞系JEG-3中，miR-30a-3p的表达受到lncRNA-SNHG12的负调控。在此基础上行侵袭试验发现，过表达SNHG12后JEG-3细胞侵袭能力升高；反之，JEG-3细胞侵袭力降低(P<0.05)。SNHG12过表达可增强滋养细胞侵袭能力，但具体机制未明。课题组前期发现，PE患者胎盘组织中存在病理性高表达的miR-30a-3p,故我们对其靶基因SLUG进行研究。发现抑制SNHG12表达，SLUG在mRNA及蛋白水平均减低(P<0.05)。我们猜测lncRNA-SNHG12可能通过“串联网络”负性调节miR-30a-3p,从而影响下游靶基因SLUG的表达抑制EMT进程。这可能是导致PE滋养细胞侵袭功能降低的机制之一。

综上所述，本次研究发现lncRNA-SNHG12在sPE患者胎盘组织中表达下调，并可能引起滋养细胞的侵袭能力失常，最终诱发PE的发生。本研究为探究PE的发病机制及诊断方法提供了新的视角。