脂联素及其受体在T2DM大鼠心肌I/R损伤中的作用及其机制

岑运光,王太昊,崔晓燕,田徐露,胡安全

(海南省人民医院，海南医学院附属海南医院保健中心，海口 570311；*通讯作者,E-mail:cenyunguang007@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种慢性疾病。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是DM的主要类型，占DM病例的90%以上，胰岛素功能抵抗和不正常的补偿性胰岛素分泌反应可能是T2DM的主要病理机制[1,2]。在中国T2DM已成为继肿瘤和心血管疾病之后对人们健康构成威胁的第三大疾病[3]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是世界范围内威胁人类生命的一种常见的致命性心脏病[4]。及时再灌注是抢救缺血心肌的关键。然而，再灌注虽然可以保护缺血心肌避免死亡，但仍能造成心肌损伤[5]。相关研究表明，T2DM能够加重患者缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的发生率，其概率大约是非糖尿病个体的5倍[6]。因此，近年来的研究集中在对T2DM心肌I/R损伤保护的机制上。

脂联素(adiponectin，APN)是一种脂肪细胞衍生的循环细胞因子，可调节胰岛素敏感性和能量稳态，对T2DM等多种疾病均有保护作用[7]。APN通过结合两种特定的受体—脂联素受体1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)和脂联素受体2(adiponectin receptor 2，AdipoR2)发挥功能[8]，AdipoR1主要在心肌中存在。已有研究表明，APN能够与AdipoR1相互作用改善糖尿病大鼠肺I/R中的心肌损伤[9]。然而，将天然APN蛋白转化为可行的常规治疗药物较为困难且成本高昂。因此，人们开发出一种脂联素受体激动剂(AdipoRon)，其能够发挥APN作用，且多项研究表明AdipoRon在动脉粥样硬化和肝纤维化中可发挥APN的保护作用[10,11]。其中，ADP355作为一种人工合成的10个氨基酸残基肽的AdipoRon相似物，其具有APN性质，可在体内激活APN的AdipoR1受体[12]。

AdipoRon可以激活腺苷单磷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)[13,14]。而后者激活又可通过抑制自噬过程中关键途径-哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路而上调自噬水平[15]。众所周知，自噬在I/R中可以改善组织损伤。然而，迄今为止，ADP355在T2DM大鼠心肌I/R损伤中对自噬的影响及相关的机制研究较少。因此，本研究旨在探讨ADP355预处理对T2DM大鼠心肌I/R损伤中APN及其AdipoR1水平的影响，以及与自噬相关的分子机制，从而为疾病的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级雄性Sprague-Dawleyo(SD)大鼠60只，7～8周龄，体质量200～220 g(南京君科生物工程有限公司)；链脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美国Sigma公司)；APD355(苏州泓迅生物科技股份有限公司)；苏木精-伊红(H-E)染色试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)；伊文氏蓝(Evan)和三苯基氯化四氮唑(TTC)试剂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；胰岛素和脂联素的ELISA试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)；RT Super Mix和SYBR Green Master Mix试剂盒(日本TaKaRa公司)；兔抗大鼠p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ、p62、β-actin(美国Cell Sigaling公司)；RT-PCR引物(上海吉玛生物制药有限公司设计与合成)。

1.2 糖尿病模型的建立与分组处理

将大鼠饲养在温度(24±2)℃，湿度40%～50%的清洁动物房环境中，12 h/12 h昼夜交替，提供足量的食物和水。将大鼠适应性饲养1周后，给所有大鼠喂食高脂高糖饲料。50 d后，大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg(现配现用，溶解在pH 4.5的0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中)。连续注射4周，每周通过尾静脉检测1次空腹血糖，大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L，并伴有多尿、多饮，则认为2型糖尿病大鼠造模成功。

按随机数字表法将造模成功的大鼠分为3组(每组20只)：糖尿病假手术组(sham组)、糖尿病心肌缺血再灌注模型组(I/R组)、ADP355+I/R组。ADP355+I/R组大鼠每周腹腔注射2 ml ADP355多肽溶液(1 mg/kg)连续4周[12]，sham组和IR组注射等体积PBS溶液。连续4周后，IR组与ADP355+IR组大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，沿着第三或第四肋骨的上边缘切开胸腔将心脏暴露，探查冠状动脉左前降支，并用6-0丝线穿线结扎；结扎缺血30 min后，释放结扎线再灌注恢复血流4 h。sham组大鼠除不进行结扎外，其余操作均相同。手术结束后，脱颈处死各组大鼠，称量各组大鼠体质量，取相关组织样本进行后续实验。

1.3 HE染色检测心肌损伤

再灌注结束时，取左心室心肌组织进行组织学检查。用4%多聚甲醛固定心肌组织，用乙醇脱水，石蜡包埋。心肌组织连续切片(5 μm)，苏木精-伊红(HE)染色切片，处理后观察结果。

1.4 Evan/TTC染色检测心肌梗死面积

采用伊文氏蓝(Evan)/三苯基氯化四氮唑(TTC)双染色方案测定心肌梗死面积。再灌注结束后静脉注射2% Evan，速冻后切片(2 μm)用1% TTC染色。正常组织为蓝色，缺血组织为红色，梗死组织为白色。用Image J软件计算梗死面积百分比(心肌梗死面积/心肌总面积。

1.5 ELISA检测胰岛素、APN水平

再灌注结束后，采集各组大鼠尾静脉血液，4 ℃离心后收集血清用于后续实验。按照试剂盒说明检测胰岛素、APN水平。

1.6 qRT-PCR检测APN及AdipoR1 mRNA表达水平

从心脏组织中提取总RNA，用RT Super Mix合成脂联素及受体的cDNA。采用SYBR Green Master Mix扩增引物，采用RT-PCR检测APN及受体AdipoR1的mRNA表达。GAPDH作为内参，各引物序列如下：①APN正向序列：5′-GCCTACCACATCACAGTC-3′，反向序列：5′-GCATTACCTGAGATACGACT-3′；②AdipoR1正向序列：5′-AAGTGGATTATTCAGGAA-3′，反向序列：5′-AATGGAGAGGTAGATGAG-3′；③GAPDH正向序列：5′-TGGACTCCACGACGTACTCAG-3′，反向序列：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAATGGAA-3′。相对表达量通过2-ΔΔCt法计算。上述实验重复3次。

1.7 Western blot检测蛋白表达

AMPK及mTOR蛋白的磷酸化水平与大鼠软骨细胞的自噬息息相关，LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ与P62是自噬发生的重要标记物。本实验将心肌组织用裂解液均质匀浆，在4 ℃离心10 min提取上清。用Bradford法测定上清液中的总蛋白浓度。从每个样品中提取等量蛋白质在10%的SDS-PAGE凝胶上分离，并转移在PVDF膜上。一抗(兔抗大鼠p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ、p62、β-actin，1 ∶1 000稀释)4 ℃下孵育过夜。用二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1 ∶5 000稀释)在室温下作用1 h。根据试剂盒的说明，使用增强化学发光检测系统观察免疫反应蛋白条带。用Image J对蛋白条带灰度进行分析。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 ADP355对T2DM心肌I/R大鼠体质量、血清中血糖、胰岛素和APN含量的影响

与sham组相比，I/R组和ADP355+I/R组大鼠的体质量、血糖含量差异均无统计学意义(P>0.05)，APN含量降低(P<0.05)，I/R组中血清胰岛素无明显变化(P>0.05)，ADP355+I/R组胰岛素含量降低(P<0.05)；与I/R组相比较，ADP355+I/R组大鼠体质量、血糖、APN含量均无变化(P>0.05)，胰岛素下降，差异有统计学意义(P<0.01，见表1)。

表1 T2DM心肌I/R大鼠体质量、血糖、胰岛素和APN含量水平Table 1 Body weight, blood glucose, insulin and APN levels in T2DM rats with myocardial

2.2 ADP355对T2DM心肌I/R大鼠心肌组织损伤的影响

用HE法检测各组心肌组织损伤的情况，结果显示，与sham组相比较，I/R组和ADP355+I/R组心肌组织损伤严重，心肌纤维排列紊乱、肌原纤维中断、细胞间隙扩大等；与I/R组相比，ADP355+I/R组的心肌组织损伤减轻，肌原纤维断裂减少，细胞间隙缩小(见图1)。

图1 ADP355改善T2DM I/R大鼠心肌组织损伤 (×200)Figure 1 ADP355 improves myocardial tissue injury in T2DM I/R rats (×200)

2.3 ADP355对T2DM心肌I/R大鼠心肌梗死面积的影响

双染色法检测心肌梗死面积，与sham组比较，I/R组和ADP355+I/R组的白色区域均增多，心肌梗死面积增加(P<0.01)；与I/R组相比，ADP355+I/R组心肌梗死的面积减小(P<0.01，见图2)。

与sham组相比，##P<0.01；与I/R组相比，**P<0.01图2 ADP355减少T2DM I/R大鼠心肌梗死面积Figure 2 ADP355 reduces myocardial infarction size in T2DM I/R rats

2.4 ADP355对T2DM心肌I/R大鼠APN及APN受体水平的影响

qRT-PCR检测大鼠心肌组织中APN及受体AdipoR1的mRNA水平，与sham组相比，I/R组和ADP355+I/R组中APN及AdipoR1的mRNA表达水平均下降(P<0.05)；与I/R组相比较，ADP355+I/R组中AdipoR1的mRNA水平上升(P<0.05)，APN的mRNA水平无变化(P>0.05，见图3)。

与sham组相比，#P<0.05，##P<0.01；与I/R组相比，*P<0.05图3 ADP355提高T2DM I/R大鼠心肌组织APN及APN受体水平Figure 3 ADP355 increases the levels of APN and APN receptor in myocardial tissue of T2DM I/R rats

2.5 ADP355对T2DM心肌I/R大鼠心肌自噬的影响

与sham组相比，I/R组和ADP355+I/R组大鼠心肌组织中AMPK磷酸化水平(p-AMPK/AMPK)、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值均上调，差异有统计学意义(P<0.01)，而P62蛋白的表达水平下调(P<0.01)；与sham组相比，I/R组mTOR磷酸化水平(p-mTOR/mTOR)上调(P<0.01)，而ADP355+I/R组该蛋白磷酸化水平下调(P<0.05)；与I/R组相比，ADP355+I/R组AMPK磷酸化水平(p-AMPK/AMPK)、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值、P62蛋白的表达水平均上调(P<0.01)，而mTOR磷酸化水平(p-mTOR/mTOR)下调(P<0.01，见图4)。

与sham组相比，#P<0.05，##P<0.01；与IR组相比，**P<0.01图4 ADP355促进T2DM I/R大鼠心肌自噬Figure 4 ADP355 promotes myocardial autophagy in T2DM I/R rats

3 讨论

治疗AMI中，再灌注是一个重要的措施。为了治疗可能会发生的再灌注损伤，现存的许多研究都以药物后处理为主。但是在T2DM中，心肌缺血再灌注损伤的发生率极高，所以预处理的治疗措施是研究热点。本研究用一种能够促进APN受体活性的衍生肽，探究其预处理对T2DM心肌I/R损伤的保护作用。

APN是一种具有生物活性的蛋白质因子，主要由脂肪细胞分泌，在糖尿病个体中其水平降低[16]。以往的研究已经证实APN具有抗肥厚、抗纤维化、抗炎症、抗凋亡和调节代谢等作用，而上述功能均有助于心脏保护[17]。ADP355具有APN的性质并能激活APN的受体，更重要的是，这种多肽在动物模型的血液中具有良好的稳定性和极低的毒性，可显示出APN的多种效应[18]。本研究用ADP355预处理T2DM大鼠4周后，进行缺血再灌注手术，之后对各项指标进行检测。结果表明，I/R组大鼠的体质量、血糖和胰岛素水平均没有明显的改变，而血清APN含量、心肌组织中APN和AdipoR1 mRNA水平却降低，而在ADP355+I/R组中，ADP355的应用可降低胰岛素水平，并提高心肌组织中AdipoR1的mRNA表达水平。说明机体内APN及AdipoR1的水平受到T2DM心肌I/R损伤的影响，这与Pieiro等[19]的研究结果一致，这也提示了ADP355预处理可能通过促进心肌分泌具有生物活性的AdipoR1发挥保护心肌的潜能。

染色结果可以看出I/R对T2DM的心肌组织造成严重的损伤和大面积的心肌梗死，但是ADP355预处理减轻了心肌损伤和梗死，这个结果与上述AdipoR1 mRNA的上调相符合，也与Otvos等[20]的研究结果相符合。这些结果均支持了ADP355作为一种直接的心肌保护分子对T2DM心肌I/R损伤的作用。

为了进一步探究心肌损伤与心肌梗死缓减的内在机制，我们又研究了相关的自噬通路。自噬是机体的一种独特保护形式，可以导致心肌代谢功能障碍[21]。自噬受到AMPK信号的调控，抑制AMPK将导致心肌自噬水平降低[22]。研究证明，APN以调控AMPK的方式刺激肌肉细胞和大鼠软骨细胞的自噬[23]，与APN缺乏类似，骨骼肌中AdipoR1的缺失也能够抑制AMPK活化蛋白激酶的信号轴[24]。本研究结果显示受损的心肌组织中，APN、AdipoR1的mRNA水平与AMPK的磷酸化水平均较低。mTOR是AMPK的下游靶点之一，是自噬过程中的关键抑制分子[25]。有研究表明，AMPK的激活可抑制mTOR信号[26]。本研究用ADP355预处理T2DM心肌I/R促进了AMPK的磷酸化，从而抑制mTOR的活化水平，这导致了自噬水平的上调，最终减轻了心肌损伤。LC3与P62是自噬发生的重要标记物，其中LC3 Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3 Ⅱ，然后进入自噬体的内外膜，直到被降解或循环进入胞质液。这种LC3 Ⅰ到LC3 Ⅱ的转化被认为是促进自噬的有力证据[27]，而P62是一种自噬底物，能够报告自噬的活性[25]。在我们的研究中，I/R组心肌组织损伤严重，P62的表达降低提示自噬活性下降，进一步说明T2DM心肌I/R大鼠的损伤可能是通过抑制自噬来实现的。而且，结果中LC3 Ⅱ/Ⅰ比值与P62水平的上调也证明了ADP355预处理促进了自噬，保护了T2DM心肌I/R损伤。

综上所述，我们的结果表明ADP355预处理可以模拟APN的作用，对T2DM心肌I/R损伤发挥治疗作用。ADP355通过上调心肌中APN受体的表达，减轻心肌损伤和减少心肌梗死面积，这可能与其激活自噬信号通路相关。因此，ADP355有望作为一种治疗T2DM心肌I/R损伤候选药物。