超高效液相色谱串联质谱法快速测定贝类中 3种腹泻性贝类毒素

2023-01-15许均图陈德斌唐春玲

食品安全导刊 2022年35期

许均图，陈德斌，陈燕，唐春玲

（广州华鑫检测技术有限公司，广东广州 510663）

腹泻性贝类毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是由原甲藻属和有毒赤潮藻类鳍藻属的藻类产生的脂溶性多环醚类生物活性毒素[1]。腹泻性贝类毒素可在贝类、鱼类等动物体内富集，性质稳定。人类食用这些被污染的水产品时，会引起急性中毒，其中毒症状主要表现为腹泻、呕吐、腹痛等[2]。赤潮在我国沿岸海域均有发生，腹泻性贝类毒素也是对我国具有最严重威胁的赤潮藻毒素之一，因此有必要加强贝类腹泻性贝类毒素的监测。

目前腹泻性贝类毒素的检测方法主要有小白鼠法、酶联免疫法、酶活力抑制分析法、高效液相色谱法以及高效液相色谱串联质谱法等[3-7]，其中酶联免疫法和酶活力抑制分析法简单快速，但是容易出现假阳性，而且不能定性是哪一种毒素。小白鼠法需要使用大量的小白鼠，不具有特异性，且灵敏度较差。高效液相色谱法需要衍生，干扰较多，稳定性较差。高效液相色谱串联质谱法是能高效分离和准确定性定量的新型分析方法，具有高的特异性和高灵敏度，被广泛应用于兽残、农残和毒素的分析检测。本研究通过优化检测条件和前处理方法，建立了快速测定贝类样品中3种腹泻性贝素的分析方法，在8 min内完成了3种腹泻性贝类毒素的快速分离测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱（液相系统：Waters UPLC，美国Waters公司；质谱系统：TSQ Quantum，美国赛默飞公司）；超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；多管涡旋振荡器（上海安谱EOAAHM-01）；氮气吹干仪（北京八方世纪BF-2000）；高速冷冻离心机（湖南赫西HR/T20MM）；电子天平（赛多利斯BSA822-CW），HLB固相萃取柱（60 mg/ 3 mL，安谱公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（200 mg/3 mL，安捷伦公司）。

甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯，MREDA公司；超纯水；其他试剂均为分析纯。

大田软海绵酸（OA）8.4 μg·mL-1、鳍藻毒素 -1（DTX-1）7.8 μg·mL-1、鳍藻毒素-2（DTX-2） 3.8 μg·mL-1，均购自加拿大海洋生物科学研究所。上述标准品均用甲醇配制成1.0 μg·mL-1的储备液，保存于-20 ℃冰箱中，用乙腈配制100 ng·mL-1的标准使用液。

1.2 样品前处理

称取（2.00±0.01）g制备均匀的样品，加入10 mL 80%乙腈溶液，振荡5 min，超声10 min，4 ℃下 10000 r·min-1离心5 min。准确移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol·L-1NaOH溶液，置于恒温箱中76 ℃下培育40 min，待冷却至室温后，加入125 μL 2.5 mol·L-1HCl溶液，所得溶液过Captiva EMR-Lipid小柱，并用1 mL 80%乙腈溶液淋洗，收集洗脱液于5 mL离心管中，混匀后过0.22 μm有机相滤膜后上机分析。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为安捷伦RRHD Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；流动相为5 mmol·L-1甲酸铵-0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），流速为0.2 mL·min-1，柱温为35℃；梯度洗脱程序：0～1 min，70% B；1～ 3 min，70%～95% B；3～6 min，95% B；6.1～ 8.0 min，10% B。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源；负离子模式；鞘气压力：35 aux，辅助气压力：15 aux，毛细管温度：350 ℃；喷雾电压3500 V；SRM扫描模式；各个化合物经优化后的质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱柱和流动相的选择

2.1.1 色谱柱

分别比较了Agilent Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）和Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），结果如图1所示。发现SB-C18的峰形拖尾严重，这可能是因为SB-C18的填料未封端，而腹泻性贝类毒素结构多为带多羟基的酸性化合物，和填料上的硅羟基作用导致拖尾。而Plus C18峰形良好，因此采用Plus C18作为分析柱。

2.1.2 流动相

分别比较了不同的流动相的分离效果，如图2所示。结果表明采用5 mmol·L-1甲酸铵-0.1%甲酸溶液+乙腈作为流动相时，3种腹泻性贝类毒素的分离度、峰形和响应最好。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂的选择

腹泻性贝类毒素都是脂溶性的化合物，不溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有机溶剂[8]。本研究分别比较了甲醇、乙腈、80%甲醇溶液、80%乙腈溶液作为提取溶剂时的总体回收率，结果见表2。

表1 腹泻性贝类毒素的质谱检测参数

图1 不同色谱柱的色谱图

图2 不同流动相组成的色谱图

表2 不同提取溶剂的总体回收率比较（单位：%）

结果表明，以80%乙腈作为提取溶剂，3种贝类毒素的总体提取效率最高。这可能是因为甲醇溶解少量脂肪带入基质干扰，而乙腈可以沉淀蛋白质，从而降低了基质效应。

2.2.2 净化方法的选择

贝类样品含有丰富的蛋白质和脂质，如果不经过净化直接上样分析，很容易污染离子源，同时较强的基质效应也会降低待分析物的响应，使得定量结果偏低，因此应选择适当的净化方式。本研究比较了HLB小柱和安捷伦Captival EMR-Lipid小柱净化的效果，结果如图3所示。

图3 不净化、EMR柱净化和HLB净化的加标样品响应值比较

结果表明，HLB小柱和Captival EMR-Lipid小柱均可以起到降低基质效应，提高响应值的效果。但是HLB小柱净化需要稀释上样，活化、淋洗、洗脱浓缩等步骤，前处理过程较为烦琐，不利于大批量样品同时处理。安捷伦Captiva EMR-Lipid小柱无需活化、能净化样品蛋白质、脂质等干扰物，操作简单。过柱后用1 mL提取液淋洗可以减少吸附，提高回收率。因此，本实验选择安捷伦Captiva EMRLipid小柱进行净化。