矢车菊素-3-O-葡萄糖苷通过Nrf2/ARE 信号通路对蛛网膜下腔出血小鼠血脑屏障完整性影响研究

杨新宇，吴伟东，范 涤，陈立刚

北部战区总医院 神经外科，辽宁 沈阳 110016

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一种严重的卒中亚型，30 d 病死率高达40%，其主要由动脉瘤破裂引起，并伴随严重的神经功能障碍［1］。手术技术的进步和诊断手段的提高使动脉瘤性SAH 的存活率增加17%，但出血带来的损伤仍无较好方法减轻［2］。早期脑损伤（early brain injury，EBI）是SAH 后72 h 内发生的一系列病理反应，是主要的致残、致死原因［3-4］。有研究显示，血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）损伤在SAH 及随后的EBI 中发挥重要作用［5］。BBB 主要由紧密连接蛋白组成，紧密连接蛋白的损伤在SAH 患者中较常见。有研究显示，脑血流灌注改变、全身炎症和氧化应激共同导致BBB 的损伤，并进一步造成脑组织的病理变化，如微循环障碍和神经细胞凋亡［6］。而保护BBB在SAH 中具有潜在的治疗意义。Cui 等［7］研究证实，Nrf2/ARE 信号通路可以通过增加紧密连接蛋白的表达，保护脓毒症小鼠BBB 的完整性。矢车菊素又名花青素，是源于蓝莓等植物中的天然抗氧化剂，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）具有强大的抗氧化、抗炎和抗肿瘤等生理功能［8］。有研究表明，C3G 可以激活Nrf2/ARE 信号通路［9］。因此，本研究旨在探讨C3G 通过Nrf2/ARE 信号通路对SAH 后EBI 的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 C3G（Solarbio，97%）、SDS聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒（碧云天，中国）、抗鼠Nrf2 单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）、抗鼠HO-1 单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）、抗兔NQO1 单克隆抗体（碧云天，中国）、抗兔ZO-1 单克隆抗体（碧云天，中国）、抗鼠Occludin单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）、抗兔Claudin-5 单克隆抗体（Abcam，英国）、鼠抗β-Tubulin一抗（碧云天，中国）、山羊抗兔二抗（碧云天，中国），兔抗鼠二抗（碧云天，中国）。选取4～6 周成年雄性C57BL/6J 小鼠54 只，购自长生生物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（辽）2020-0001；体质量22～30 g。将小鼠随机分成假手术组、模型组、C3G组，每组各18 只。

1.2 研究方法

1.2.1 动物模型建立 采用血管穿刺法制作SAH模型［10］。取颈正中开口，分离颈总血管，颈内血管和颈外血管。在颈外剪口插入长1.500 cm，直径0.625 mm尼龙线。打开颈内，将尼龙线穿入颈内并推动刺破颈内动脉的分叉，当感受到落空或小鼠呼吸节律改变时即表示造模成功。然后，取出尼龙线并结扎颈外血管，打开颈总血管并缝合切口。

1.2.2 实验设计 模型组小鼠采用血管穿刺法［10］制作SAH 模型，假手术组小鼠采用相同的操作方法处理但不刺破血管，C3G 组小鼠在SAH 模型建立30 min 后经腹腔注射给予C3G 20 mg/kg［11］。24 h 后评估小鼠SAH 分级评分、加西亚评分。全部脱颈处死后，取出血侧脑组织，每组随机取6 只，检测小鼠脑水含量。再每组随机取6 只，检测小鼠依文思蓝渗出量。余下小鼠利用蛋白免疫印迹法检测Nrf2，HO-1，NQO1，ZO-1，Occludin 及Claudin-5 的含量。

1.2.3 SAH 分级评分 SAH 分级评分根据Sugawara评分标准［12］对SAH 后小鼠的基底池血凝块进行0～3 级评分。SAH 出血分级的最终评分为6 个部位之和，0～7 为轻度出血，8～12 为中度出血，13～18 为重度出血。排除评分＜8 分的，将中度出血和重度出血纳入选定模型。

1.2.4 加西亚评分 每组取6 只C57BL/6J 小鼠，根据参考文献［12］中描述的方法进行评估。见表1。

表1 加西亚评分标准

1.2.5 干湿法检测脑水含量 建模后24 h，小鼠采用脊椎脱臼法处死，取脑组织于110℃下烘烤72 h。脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%

1.2.6 依文思蓝渗出量 每组取6只C57BL/6J 小鼠，于取材前1 h，经尾静脉给予2% 伊文思蓝溶液5 ml/kg，全身循环1 h 后，进行生理盐水灌注，然后迅速取出出血侧脑组织，立即称重。按10 ml/g 将组织浸润到甲酰胺溶液中，60℃恒温孵育24 h，待伊文思蓝浸出，收集浸出液，于酶标仪620 nm 处测定其吸光度。

1.2.7 蛋白免疫印迹实验 将C57BL/6J 小鼠脱颈处死后立即取出出血侧，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液，在冰上进行充分研磨，取上清液。部分上清液使用BCA 检测试剂盒进行蛋白定量检测，其余上清液加入loading buffer 溶液后煮沸，分装保存于-80℃。本研究根据蛋白分子量大小选取12% 浓度分离胶，5% 浓度浓缩胶。随后进行电泳，并将蛋白转移至PVDF 膜上。使用5%的BSA 在恒温37℃摇床下充分封闭1 h，然后在4℃下孵育一抗过夜。次日用TBST 溶液洗条带3 次，每次10 min，在恒温37℃摇床下孵育二抗1.5 h，TBST溶液洗条带3 次，每次10 min。最后使用BeyoECL发光溶液，在自动曝光机下曝光。β-actin 作为内参计算蛋白表达水平，使用Image J 软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 9 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以例（百分率）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠SAH 分级评分、加西亚评分比较 建模后24 h，与假手术组相比，模型组、C3G 组SAH 分级评分均显著增加，但与模型组比较，C3G 组SAH分级评分显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 3组小鼠SAH分级评分、加西亚评分比较（a.SAH分级评分；b.加西亚评分）

2.2 3 组小鼠脑组织水含量和脑血管通透性比较 建模后24 h，与假手术组比较，模型组、C3G 组脑含水量和伊文斯蓝渗出量均显著增加，但与模型组比较，C3G 组脑含水量和伊文斯蓝渗出量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 3组小鼠SAH后的脑组织水含量和脑血管通透性比较（a.脑水含量；b.依文思蓝含量）

2.3 3 组小鼠Nrf2/ARE 信号通路蛋白表达的比较 建模后24 h，与假手术组比较，模型组、C3G 组脑组织中Nrf2/ARE 信号通路中的分子Nrf2、HO-1及NQO1 蛋白表达水平显著降低，但与模型组比较，C3G 组Nrf2、HO-1 及NQO1 蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 3组小鼠Nrf2/ARE信号通路蛋白表达的比较

2.4 3 组小鼠脑组织粘附连接蛋白表达的比较 建模后24 h，与假手术组比较，模型组、C3G 组脑组织中ZO-1、Claudin-5、Occludin 蛋白表达水平均显著降低但与模型组比较，C3G 给药后能够显著恢复这种变化，增加 ZO-1、Claudin-5、Occludin 蛋白的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 3组小鼠脑组织粘附连接蛋白表达的比较

3 讨论

SAH 是较严重的卒中亚型之一，占所有卒中的5%［2，13］。尽管SAH 不如缺血性卒中和脑出血常见，但由于患者通常年龄较小，发病率和病死率高，预后差，严重影响患者生存质量［1，4］。在SAH 后的72 h内，颅内发生了一系列病理变化，BBB 破坏，颅内压升高，脑血流减少以及一些促进血管收缩、氧化应预后不良的关键机制之一，在EBI 过程中，BBB 通透性显著增加，BBB 完整性的结构和功能损害都会导致血管生成因子的变化［15-16］。Claudin-5 的显著下降和白蛋白的升高是检测BBB 破坏的标志因子［17］。有研究证明，Nrf2 作为一种抗氧化相关的转录调节因子，可能作为上游靶标来保护免受BBB 损伤。Nrf2 激活剂也被证明是治疗中枢神经系统疾病的有效方法［18］。C3G 是一种强大的抗氧化剂，其可以穿过BBB 并定位于广泛的大脑区域，包括皮质、小脑、海马体和纹状体等，从而发挥作用［19］。Cui 等［20］研究证明，C3G 可减少缺血性卒中患者MCAO/R 诱导的神经损伤、神经元凋亡和脑梗塞体积的增加。C3G的神经保护作用的关键机制之一是抑制神经炎症和氧化应激，保护神经元免受缺血/再灌注损伤［21］。

在本研究发现，C3G 可以降低小鼠SAH 分级评分，改善小鼠SAH 后的神经功能，并能够减轻脑水肿，保护BBB 的完整性。另外，本研究还发现，C3G可上调Nrf2 的表达，增加OH-1，NQO1 等抗氧化因子的表达水平，抑制氧化应激作用，从而增加小鼠SAH 诱导的ZO-1，Claudin-5，Occludin 等紧密连接蛋白的表达。紧密连接是构成BBB 的基础，其通过控制BBB 相邻脑内皮细胞之间的细胞旁空间运输，增加其表达，从而保护BBB，严格调节血液和中枢神经系统之间的离子和分子交换［22］。本研究结果提示，C3G 在SAH 后可以通过激活Nrf2/ARE 信号通路中抗氧化相关因子的产生，保护BBB 完整性，从而减轻EBI。

综上所述，C3G 能够作用于Nrf2/ARE 信号通路，保护SAH 后血脑屏障的完整性，在SAH 的治疗中具有良好的应用前景。