细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A 与肾细胞癌患者临床及预后指标相关性研究

郭海锋，罗小冬，姜 力，吴佳成，郭 猛

1.南通大学附属肿瘤医院 南通市肿瘤医院 泌尿科，江苏 南通 226361 ；北部战区总医院2.儿外科；3.心内科，辽宁 沈阳 110016

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常见的泌尿系统致死性疾病，是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的肾恶性肿瘤［1］。全球肾癌发病人数呈现逐年上升的趋势，预计至2030 年发病人数将达到52.0 万人［2］。RCC 的组织类型包括透明细胞型、乳头状细胞癌及嫌色细胞癌［3］。约65%的RCC 患者表现为局限性肿瘤，其余患者表现为转移性RCC，通过手术切除无法治愈，常需要配合全身治疗［4］。RCC 早期或局部病变手术治愈率超过90%，局部晚期RCC 患者的5 年存活率为40%～60%［5］。因此，研究RCC 发生和进展相关的生物标志物对治疗RCC 尤为重要。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）参与不同肿瘤的增殖、转移［6］。而CDKN2A 在RCC中的作用相对研究较少。有研究表明，CDKN2A 是铜死亡相关基因之一［7］。铜死亡相关基因通过铜与三羧酸循环的脂酰化成分直接结合，导致脂酰化蛋白的异常聚集和铁硫簇蛋白的丢失，从而导致蛋白毒性应激而导致细胞死亡［8-9］。而CDKN2A 作为具有双重身份的特殊基因，其在肿瘤中发挥的具体作用还需要进一步的探索。本研究旨在探讨CDKN2A的表达及其在预测RCC 患者存活率中的作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 通过TCGA 数据库下载531 个RCC 患者的临床参数，包括患者的年龄、性别、TNM分期、病理分级、总体生存期（overall survival，OS）、疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）和无进展间隔期（progression free interval，PFI）等参数，进行数据分析。

1.2 研究方法 下载RCC 患者的临床参数CDKN2A和这些临床参数以及预后之间的相关性。构建列线图预测RCC 患者1、3 和 5 年存活率。笔者通过TIMER 数据库构建棒棒图展示在RCC 中CDKN2A表达和各免疫细胞之间的相关性。使用Metascape在线进行功能分析。将差异基因添加到Metascape中进行功能分析。考虑到转移复发的RCC 对于对放化疗不敏感，后期治疗首选靶向治疗为基础的综合治疗，将CDKN2A 与靶向药物的靶点分子进行相关性研究。

1.3 统计学方法 采用软件R（3.6.3 版本）进行统计分析。R 包：GEOquery 包（2.54.1 版本）进行数据下载，limma 包（3.42.2 版本）进行差异分析［10-11］。通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探讨CDKN2A 可能作用的细胞机制。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RCC 组织中CDKN2A 表达升高 在RCC 肿瘤组织中，CDKN2A 的表达升高。构建受试者工作特征曲线，曲线下面积为0.991，提示CDKN2A 具有很好的预测效果。见图1。

图1 RCC组织中CDKN2A表达降低（a.CDKN2A在RCC非配对组织中的表达情况；b.CDKN2A在RCC配对组织中的表达情况；c.受试者工作特征曲线）

2.2 CDKN2A 与RCC 临床资料的关系 较高的TNM 分期、病理分期、组织学分级的RCC 患者中CDKN2A 的表达更高。见图2。

图2 CDKN2A分子与RCC患者的临床资料的相关性

2.3 CDKN2A 与RCC 预后相关性 CDKN2A 低表达的RCC 患者OS、DSS、PFI 优于CDKN2A 高表达的患者，即CDKN2A 低表达的RCC 患者的预后明显优于CDKN2A 高表达患者。见图3。

图3 TCGA数据库中CDKN2A与RCC患者预后情况（a.CDKN2A低表达RCC患者OS；b.CDKN2A低表达RCC患者DSS；c.CDKN2A低表达RCC患者PFI；d.T1的RCC患者中，CDKN2A低表达患者预后情况；e.M0的RCC患者中，CDKN2A低表达患者预后情况；f.年龄≤60岁的RCC患者中，CDKN2A低表达患者预后情况）

2.4 列线图个性化预测RCC 患者1、3 和 5 年的存活率 笔者基于多变量分析的结果构建列线图，列线图预测RCC 患者1、3 和 5 年的存活率的C-指数为0.749（0.721～0.776）。校准图中的偏差校正线接近理想曲线，表明预测值和观察值之间具有良好的一致性。见图4。

图4 列线图预测RCC患者存活率及校准图（a.列线图预测RCC患者1、3、5年OS率；b.预测OS率列线图的校准图）

2.5 CDKN2A 与免疫细胞相关性 笔者通过TIMER 数据库构建棒棒图展示在RCC 中CDKN2A表达和各免疫细胞之间的相关性。CDKN2A 的表达与大部分浸润性免疫细胞之间呈显著相关性，进一步分析发现CDKN2A 表达与免疫检查点相关分子细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4），表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）、细胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PDCD1）都具有较好的相关性。见图5。

图5 CDKN2A与免疫细胞相关性（a.CDKN2A与TIMER数据库中免疫细胞的浸润程度的相关性；b.CDKN2A表达与RCC中的免疫细胞浸润显著相关；c.CDKN2A表达与CTLA-4相关性散点图；d.CDKN2A表达与CD274相关性散点图；e. CDKN2A表达与PDCD1相关性散点图）

2.6 CDKN2A 的共表达基因分析 根据TCGA 数据库的数据识别与CDKN2A 共表达的正相关或负相关的基因各50 个。见图6。

图6 CDKN2A的共表达基因分析（a.RCC中与CDKN2A正相关的前50个基因；b.RCC中与CDKN2A负相关的前50个基因）

2.7 CDKN2A 与分子靶向治疗药物靶点分子之间的相关性 分析CDKN2A 与分子靶向治疗药物靶点分子之间的相关性发现，CDKN2A 与KIT，MET，TEK和血管内皮生长因子B 都有较好的相关性。见图7。

图7 CDKN2A与分子靶向治疗药物靶点分子之间相关性（a.MET；b.TEK；c. 血管内皮生长因子B；d.KIT）

2.8 基于GSEA 信号通路预测 笔者使用Metascape在线进行KEGG 功能分析，发现CDKN2A 可能通过参与影响细胞周期，调节p53，铜离子稳态，肿瘤衰老和细胞毒性这些方面来影响RCC 的生物学事件，从而导致RCC 的不同预后。

3 讨论

肾癌在我国属低发瘤种，但人口基数大，发病数较多［12］。因此，阐明RCC 发生发展的机制，以发现重要的生物标志物并制定新的治疗策略具有重要意义。

近年来，测序和组学技术的发展为进一步了解RCC 的机制和探索诊断和治疗靶点提供更多机会［13］。在TCGA 数据库中，笔者发现CDKN2A 在RCC 中表达升高，而且CDKN2A 低表达的RCC 患者的较CDKN2A高表达的患者有更好的预后。TIMER 数据库的数据分析结果及与免疫检查点相关分子CTLA-4，CD274、和PDCD1 都具有较好的相关性，表明CDKN2A 的表达可能与免疫浸润显著相关。本研究结果显示，CDKN2A 与KIT，MET，TEK 和血管内皮生长因子B 都具有较好的相关性，对于靶向药物的选择可以提供更好参考性。Ⅲ期临床JAVELIN Renal 101 临床试验证实，对于进展期RCC 患者，Avelumab 联合Axitinib（联合组A+Ax）比Sunitinib（靶向组S）具有更好的无疾病进展生存期和客观缓解率［14-15］。本研究结果显示，CDKN2A 与RCC 的免疫浸润及靶点分子相关。

笔者基于GSEA 富集进行信号通路的预测，发现CDKN2A 可能通过参与影响细胞周期，调节p53，铜离子稳态，肿瘤衰老和细胞毒性这些方面来影响RCC 的生物学事件，从而导致RCC 的不同预后。笔者研究的分子CDKN2A 属于铜死亡相关基因，在TCA 循环中蛋白质脂酰化过程中发挥上游调节作用［16］。既往研究表明，CDKN2A 通过 LDHA 介导的AKT/mTOR 通路抑制宫颈癌的细胞增殖和侵袭［17］；前蛋白转化酶的抑制削弱p53、CDKN2A 和N-Ras 基因改变对人原发性黑素瘤细胞的侵袭性［18］。笔者推测，CDKN2A 通过TP53 调节参与RCC 的周期阻滞，从而导致RCC 患者的不同预后。

综上所述，CDKN2A 的表达降低可以显著延长RCC 患者的OS，PFI 和DSS，可以用作RCC 的新型预测性生物标志物，同时,可能与RCC 的免疫浸润相关，并在RCC 微环境中对于肿瘤细胞发生免疫逃逸可能起着重要的促进作用。干扰CDKN2A 可能通过参与TP53 调节RCC 的周期阻滞，从而改善RCC的预后。这些发现为RCC 抗癌策略的开发提出一个潜在的靶点。