黄甲软肝颗粒对小鼠急性肝损伤和肝纤维化的保护作用研究

高晓新 李雪梅 王佳帅 朱春玥 曹春然

北京市药品检验研究院药理毒理室，国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京，102206，中国

肝脏是人体重要的器官，具有消化、吸收、代谢、解毒和造血等多种功能，是人体解毒、物质贮藏和代谢的重要场所。多种因素可致急性肝损伤，应及时去除病因并加以治疗，长期的肝损伤会导致肝组织的纤维化，还可能进一步引起肝硬化、肝癌的发生。因此防治急性肝损伤和肝纤维化具有重要的临床意义。

组方黄甲软肝颗粒，主要成分是黄芪、葛根、灵芝、鳖甲、三七等，基于中医中药理论具有理气疏肝，活血软坚的功效。有研究发现，黄芪粗提物、黄芪总皂苷、黄芪甲苷对大鼠急性肝损伤和肝纤维化均具有缓解作用［1-5］，同时葛根素也具有一定的治疗急性肝损伤和抗肝纤维化作用［6-9］。本文通过建立小鼠急性肝损伤和肝纤维化模型来考察黄甲软肝颗粒对肝的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级ICR 小鼠、BALB/c 小鼠，体质量均为（18～22）g，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，使用许可证号：SCXK（京）2015-0033，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 药物与试剂

黄甲软肝颗粒，由A 公司提供，批号：HJ 170206；复方鳖甲软肝片，由A 公司提供，批号：20170604。

D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-Gal N），批号20170102，Sigma 公司；刀豆素蛋白A（concanavalin A，Con A），批号066K7031，Sigma 公司。

1.1.3 仪器

AU400 型 生化 仪，OLYMPUS；XH6080 γ计数 器，西核仪厂；Typ3151 准自动化化学发光仪，德国Lumino。

1.2 实验方法

1.2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝损伤的作用

选用健康ICR 小鼠，体质量（18～20）g，84 只，雌雄各半，按体质量随机分成6 个组，分别为阴性对照组、模型组、阳性药组（复方鳖甲软肝片，2.0 g·kg-1），黄甲软肝颗粒高、中、低剂量组（生药20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。按20 mL·kg-1每天小鼠灌胃给药一次，阴性对照组和模型组灌胃同体积的去离子水，连续给药14 d。给药后d 13，除阴性对照组以外，其余各组小鼠均腹腔注射D-Gal N 0.8 g·kg-1，禁食禁水16 h 后，于末次给药后60 min，小鼠眼底静脉丛取血，测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）的值［10］。摘取肝脏、脾脏称重，计算肝指数、脾指数（g·10 g-1）

组织病理学检查：选取相同部位肝脏制作HE 切片。每张切片随机选3 个视野，分别按照下面的标准根据病变程度进行病理分级，并取其平均值作为该动物肝脏的病理分级。各组与模型对照组比较，进行统计学分析。

病变程度分级标准：0 级：肝脏组织结构正常，未见异常病变；1 级：肝细胞轻度浊肿；2 级：肝细胞浊肿/水样变/脂肪变性，肝灶状坏死，坏死面积较小，坏死灶内可见均质圆球状嗜酸性小体；3 级：肝细胞浊肿/水样变/脂肪变性、肝灶状坏死，坏死灶面积较大，严重时发生融合。坏死灶内可见均质圆球状嗜酸性小体，数量较多。

1.2.2 Con A 致小鼠肝纤维化小鼠的作用

选用健康BALB/c 小鼠，体质量（18～20）g，96 只，雌雄各半，按体质量随机分成阴性对照组、模型组、阳性药组（复方鳖甲软肝片，2.0 g·kg-1）、黄甲软肝颗粒高、中、低剂量组（生药20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。除阴性对照组以外的动物按照12.5 mg·kg-1尾静脉注射Con A（Con A以无菌的PBS 配制成0.625 mg·mL-1的浓度，小鼠按照0.2 mL·10 g-1尾静脉注射），阴性对照组动物注射同体积的无菌PBS，各组每周注射1 次，共注射7 次［11-12］。于第4 次注射当天，各组开始灌胃给药，阴性对照组及模型组给予同体积去离子水，1 次·d-1，连续给药4 周（遇到注射日，则注射与给药分别进行）。于末次给药后 24 h，小鼠眼静脉丛取血，分离血清，测定ALT 和AST，摘取肝、脾称重，计算肝脾指数（g·10 g-1），各组与模型比较，进行统计学分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0 进行统计处理，病理分级数据采用卡方检验，其它数据用组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝损伤的作用

小鼠血清ALT、AST 的变化如Tab.1 所示。与阴性对照组比较，小鼠腹腔注射D-Gal N 后血清ALT、AST 显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，黄甲软肝颗粒各剂量组及阳性药组的ALT、AST 均显著降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；**P＜0.01 vs model group.

各组小鼠肝脾指数的变化如Tab.2 所示。与阴性对照组比较，小鼠注射D-Gal N 后肝脾指数均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠的肝指数有降低趋势，但无统计学差异；各给药组的脾指数均降低且有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

病理学分级结果如Tab.3 所示。小鼠注射D-Gal N 后肝损伤程度明显比阴性对照组动物严重，具有显著差异，阳性药组动物及黄甲软肝颗粒各剂量组动物肝损伤程度与模型对照组比较显著减轻。

Tab.3 Effects of Huangjiaruangan gruanules on liver histopathology of D-Gal N induced acute liver injury in mice（n=14）

2.2 Con A 致肝纤维化小鼠的影响

小鼠生化指标的变化如Tab.4 所示。与阴性对照组比较，小鼠注射Con A 后血清ALT、AST 显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，黄甲软肝颗粒高、中剂量组及阳性药组的ALT 及AST 值均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

小鼠肝脾指数的变化如Tab.5 所示。与阴性对照组比较，小鼠注射刀豆素蛋白A 后肝脾指数均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄甲软肝中剂量组的肝指数明显减小（P＜0.05），其它给药组肝脾指数有降低趋势但无统计学意义。

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

3 讨论

Gal N 具有很强的毒性，进入肝脏后引起肝细胞变性坏死，使细胞内大量ALT 和AST 大量释放，引起肝细胞变性，炎性浸润以及坏死等。D-Gal N 致急性肝损伤是利用D-Gal N 的肝毒性造成急性肝损伤的动物模型，是目前公认的较为经典的研究急性肝损伤的动物模型［10］。ALT 分布在肝细胞浆、AST 分布在肝细胞线粒体中，ALT、AST 升高分别反应了肝细胞膜和肝细胞内细胞器的损伤，是反应肝损伤的敏感指标［11］。脏器系数是毒理学实验中的常用指标，脏器系数增大或减少在一定程度上反应脏器的损伤程度。本研究小鼠注射D-Gal N 后血清ALT、AST 和肝脾系数明显升高、肝脏出现组织病理损伤。与模型组比较，黄甲软肝颗粒各组均能显著降低血清ALT 和AST 的水平、均降低肝脾指数且脾指数降低有显著性，组织病理学检查发现各给药组动物肝损伤程度显著减轻。综上所述，黄甲软肝颗粒对D-Gal N 所致的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。

小鼠反复注射Con A 致肝纤维化［12-13］，该模型中肝细胞受损不严重，炎症反应引起胶原沉积为其主要表现，适合予以研究肝纤维化免疫疾病、吞噬细胞、Ito细胞及自身免疫性肝病等方面问题［14］。本研究中，小鼠注射Con A 可引起血清ALT、AST 和肝脾指数显著升高；黄甲软肝颗粒高、中剂量组可有效降低模型动物血清ALT、AST 升高水平，且黄甲软肝中剂量组的肝指数明显减小、其它给药组肝脾指数有降低趋势。综上所述，黄甲软肝颗粒对Con A 引起的肝纤维化有一定的治疗作用。

综合本实验结果，可证实黄甲软肝颗粒对小鼠D-Gal N 致急性肝损伤有明显的保护作用并对Con A引起的肝纤维化有一定的治疗作用，为其临床使用提供实验依据。