宏基因二代测序与传统检测方法在中枢神经系统感染中的对比观察

张晓杰 范 磊 潘妍婷

1 河北北方学院研究生院，张家口，075000，中国

2 河北北方学院附属第一医院神经内科，张家口，075000，中国

3 张家口市第一医院，张家口，075000，中国

目前中枢神经系统（central nervous system，CNS）感染性疾病的病原学诊断主要依靠脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）涂片镜检、病原体培养、抗原抗体检测、PCR 检测，但其阳性率低［1-2］。近年来，二代测序以其“高通量优势”在临床中广泛应用，宏基因二代测序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）在中枢神经系统感染性疾病病原学检出率及诊断水平提高中发挥重要作用。与常规检测方法相比，mNGS技术的阳性百分比、一致性显著增加，同时提高病原体的识别率［3］。本研究收集我院诊断中枢神经系统感染的60 例患者，分析脑脊液培养与mNGS 方法的敏感性，探讨mNGS 技术在中枢神经系统感染患者脑脊液中提供病原学证据的效能差异及临床诊治中的指导意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾分析河北北方学院附属第一医院2019 年5月～2021 年5 月神经内科住院且临床确诊为中枢神经系统感染患者60 例。

1.2 研究方案

收集同期临床确诊的中枢神经系统感染的患者60例，疾病纳入标准［4］参考王维治主编的《神经病学》中枢神经系统感染的临床诊断标准排除标准，包括：①年龄≤28 d；②脑脊液细胞学证实脑膜恶性肿瘤；③损伤所致明显血性脑脊液；④已经确诊自身免疫性脑炎的病例；⑤HIV、梅毒感染或者拒绝签署知情同意书。将每个组别的脑脊液同期进行脑脊液传统检验和mNGS检测，观察mNGS 方法的阳性检出率及指导临床选用抗菌素的治疗效果。本研究通过河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.3 CSF 标本的收集

患者入组后尽早留取CSF，需注意严格无菌操作，避免损伤性出血导致溶血，控制颅内高压患者的放液速度，避免脑疝形成；经引流管道采集时，排去管腔内约3～5 mL 的潴留液体，尽可能收集新鲜CSF。标本收集后立即分装至无菌、干燥、洁净的冻存试管内，每一标本的留取量应≥1.5 mL。

1.4 检验方法

试管内标本同时行mNGS 及微生物培养检测。微生物培养方法：在无菌条件下，将CSF 标本或其离心沉淀物分别接种于血平板、巧克力平板、麦康凯平板，5.5%CO2：，35℃条件下，培养18～48 h，获取菌株后进行鉴定。mNGS 由广州金域医学检验集团股份有限公司完成，CNS 感染特征确定参考数据库，所用数据库包括细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体或衣原体。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0 及MedCalc15.2.2 统计学软件对数据进行统计学分析。分类变量以例数（百分率）表示，近似服从正态分布的连续性变量以均数±标准差表示。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算曲线下面积（areaunder the curve，AUC），以AUC=0.5 为诊断参考线，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

分析的中枢神经系统感染的60 例患者中，有慢性病史者9 例（15.0%），送检化验前使用抗生素6 例（10.0%），影像检查伴有脑脓肿患者5例（8.33%），脊髓脓肿2 例（3.33%）。按不同感染源进行分组（Tab.1），细菌感染42 例（70%）；病毒感染16 例（26.67%）；寄生虫感染2 例（3.33%）。

Tab.1 mNGS results of 60 patients with central nervous system infection

2.2 mNGS 结果

总体阳性例数为52 例（86.67%），对细菌感染的阳性例数为40 例（95.24%），病毒感染阳性11 例（68.75%），寄生虫感染阳性1 例（50%）。mNGS 对细菌和病毒的阳性率进行卡方检验，P＜0.05（P=0.004），提示差异有统计学意义（Tab.2）。

Tab.2 Analysis of mNGS results

2.3 mNGS 对入组中枢神经系统感染患者的诊断效能评价结果

ROC 曲线分析显示（Fig.1），mNGS 的AUC 为0.705，诊断价值中等，与AUC=0.5 的诊断参考线比较P＜0.05，差异有统计学意义。

Fig.1 Receiver operating characteristic（ROC）curve for mNGS diagnosis of CNS infection（n=60）

2.4 实验室检查结果

所有病例均完善血细胞分析、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、肝功能、肾功能、电解质及脑脊液常规、生化等基础检验项目，60 例病人C-反应蛋白、降钙素原、脑脊液中白细胞、脑脊液压力出现不同程度增高（Tab.3）。

Tab.3 Laboratory tests were positive in 60 patients with CNS infections

2.5 影像资料

病毒感染组核磁结果平扫阳性例数13 例，细菌感染组核磁平扫结果阳性例数30 例，其中5 例伴有脑脓肿，2 例脊髓脓肿患者以及2 例寄生虫感染者，均由增强核磁进一步明确诊断。

3 讨论

有统计数据显示，脑炎患者中约63%的病例是病原体诊断不明［5］。对于脑炎而言，明确其是自身免疫因素还是感染性疾病导致的炎症，对于其后续的诊治方案选择具有重要意义，这更加彰显出明确病原体的重要 性［6］。临床工作中发现，mNGS 技术在中枢神经系统感染性疾病病原学的诊断与其他传统诊断方法比较有一定的优越性［7］。有文献提示脑脊液常见的病毒、细菌、寄生虫感染中mNGS 技术较传统检验方法有较高的敏感性及特异性［8］。本组患者分析结果提示，脑脊液mNGS技术对中枢神经系统感染的总的阳性率为95.24%，与文献报道类似［9］。mNGS 技术提高病因检测阳性率，尤其在传统病原菌检测阴性时，可有效辅助临床诊断。

通过mNGS 结果分析，可进一步提示细菌的种属信息，为临床工作提供精准的治疗信息。本组中1 例患者mNGS 检查结果，细菌种属提示为革兰阴性普雷沃菌系口腔细菌，给予奥硝唑治疗，临床症状明显好转。另外2 例脊髓脓肿患者，经强化磁共振证实诊断，但多次送检常规脑脊液化验均为阴性，而送检二代测序提示布氏杆菌感染，目前相关文献并无布氏杆菌导致脊髓脓肿病例报道。因此对于慢性及不明原因感染患者与传统检验方法相比，mNGS 技术可作为更有效的检测手段［10］，并可有效缩短疾病的诊断及治疗时间。

mNGS 对病毒、真菌等非细菌类病原体的检出存在着其固有优势。微生物培养的检测阈值仅为100～1 000 CFU·mL-1，mNGS 的检测阈值在0.01～ 130.00 CFU·mL-1［11］。其次，mNGS 的检测对象是病原体基因序列，不区分病原体活性，对已接受广谱抗生素经验治疗的患者，其CSF 中病原体仍可在mNGS 中检出。但mNGS 技术作为新型的病原微生物检测技术，检测技术昂贵，无法同步提供药敏结果。总之，脑脊液mNGS 虽然还有待进一步完善与标准化，但为中枢神经系统感染病因精准诊疗带来了显著的进步。这种诊断方法显著缩短诊断、治疗时长，能够识别新出现的感染病原体和新发感染性疾病。在病原体诊断技术相对落后的基层医院和临床实践中如何合理应用mNGS，并与传统微生物检测方法相结合，以提高神经感染性疾病的诊治水平。

综上所述，在中枢神经系统感染诊疗中，mNGS 较传统检验具有更好的诊断效能，可以作为微生物培养等常规诊断技术的必要补充，进一步为中枢神经系统感染提供精准治疗依据。